Cell Stem Cell:刘真/孙强/周帆研究组合作利用胚胎干细胞建立非人灵长类类胚胎模型

2023年4月6日，《Cell Stem Cell》期刊在线发表了题为《食蟹猴胚胎模型体外培养发育到原肠胚和引起早期妊娠反应》的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘真研究组、非人灵长类研究平台孙强研究团队与清华大学生命科学学院周帆研究组合作完成。该研究利用胚胎干细胞建立了食蟹猴类囊胚诱导系统，体外培养食蟹猴类囊胚可诱导原肠运动的相关胚层，体内移植可以检测到早期妊娠囊的出现。 

胚胎着床至原肠运动是发育的关键时期，也是临床上早期流产的高发期。相较于啮齿类模式动物，灵长类着床至原肠运动时期的研究严重滞后。基于胚胎干细胞组装的类胚胎研究为灵长类早期着床发育提供了新的途径。目前小鼠胚胎干细胞来源的类胚胎能体外培养到神经发生和器官发生阶段，人胚胎干细胞诱导获得的类囊胚也可以模拟囊胚阶段的形态和分子特征。 

非人灵长类拥有与人更为相近的生殖发育和胚胎发育特点，是研究人类生殖和胚胎发育的理想动物模型。研究团队创新性地用非人灵长类胚胎干细胞代替人多能干细胞，进行食蟹猴类囊胚体外诱导。研究人员通过比较不同培养状态的食蟹猴胚胎干细胞以及优化体外诱导体系和方法，高效得到了形态上和食蟹猴囊胚非常接近的类囊胚。结合单细胞转录组测序与分析、三个谱系干细胞体外分离培养，以及其他一系列分子细胞实验证明食蟹猴类囊胚在主要细胞谱系组成以及相应的转录组水平等和正常囊胚相似（图1A-B）。为了研究其体外发育潜能，研究人员对食蟹猴类囊胚进行了长时程体外延迟培养。 

当体外培养至D15，类囊胚发育至早期着床的双层胚盘状结构，包括典型的OCT4+的EPI样外胚层结构和明显的羊膜腔以及GATA6+的卵黄囊腔（图1C）。研究人员进一步培养发现，体外培养至D17，前面出现的双层胚盘样结构的食蟹猴类胚胎中会有一小部分继续发育，形成圆盘样结构，并包含前后轴、原条，绒毛膜腔等特征性细胞群体，且部分形态与之前报道的人类CS7（E16-19）时期的体内原肠胚相似（图1D）。免疫荧光染色结果进一步展示了其形态特征（图1E）。结合测序数据的挖掘和对比分析，作者发现D17食蟹猴类胚胎具有上胚层细胞（EPI）, 原条细胞（gastrulating cells）, 原始生殖细胞（PGCs）, 羊膜上皮细胞（AME）, 胚外中胚层细胞（EXMC）, 滋养层细胞（TE）, 内脏内胚层/卵黄囊内胚层细胞（VE/YE）等。此外，D17食蟹猴类胚胎中还检测到了原始造血相关细胞，包括造血内皮细胞 (HECs), 造血内皮祖细胞 (HEPs)以及幼红细胞(Ery)。这意味着D17食蟹猴类胚胎已经进入三胚层分化阶段。 

研究团队进一步分析鉴定发现D17食蟹猴类胚胎还具有胚胎非神经外胚层（NNE）、新生中胚层（NM），晚期中胚层（AM）、定型内胚层（DE）等三胚层类似的细胞群体（图1F）。该研究揭示了D17食蟹猴类胚胎无论从形态还是细胞谱系组成上都与之前报道的人的CS7（E16-19）时期的体内原肠胚相似，提示诱导的类囊胚具有模拟着床后发育的能力。研究团队将该发育潜能的食蟹猴类囊胚进行同种体内移植，进一步检测其体内发育潜力。结果显示，3/8受体在移植后能检测到明显的着床点和早期妊娠囊的出现，同时伴随血清中绒毛膜促性腺激素和孕激素水平的提高（图2）。 

该研究利用胚胎干细胞体外重构了非人灵长类类囊胚，并对其体内外发育潜能进行深入全面的探究和评估，首次将非人灵长类的类囊胚体外培养至着床后原肠胚时期。 

中科院脑智卓越中心博士后李杰，清华大学周帆课题组科研助理朱庆元，中科院脑智卓越中心与西北农林科技大学联合培养博士生曹静，清华大学2021级博士生刘莹、中科院脑智卓越中心非人灵长类研究平台实验师陆勇为该论文共同第一作者。中科院脑智卓越中心孙怡迪研究员、孙怡宁、黄奕铭、尚申申、卞新颜、李春杨、张连升博士、王燕、聂艳红、傅吉强博士，清华大学2021级博士生李倩，中科院广州健康院Miguel A. Esteban研究员、李文娟博士、Md. Abdul Mazid博士、姜禹、贾雯淇，西北农林科技大学王晓龙研究员为本研究提供了重要帮助。该研究得到科技部、中科院、上海市、基金委和临港实验室的资助。 

图1.（A）非人灵长类食蟹猴类囊胚体外重构。（B）scRNA-seq分析体外重构的非人灵长类食蟹猴类囊胚的细胞谱系构成。（C）非人灵长类食蟹猴类囊胚体外延迟培养至D15时形成的双层胚盘样结构。（D）非人灵长类食蟹猴类囊胚体外延迟培养至D17时形成的原肠胚样结构。（E）非人灵长类食蟹猴D17类胚胎的形态学染色。OCT4, EPI marker. GATA6, amine marker. T(Brachyury), gastrulation marker. （F）非人灵长类食蟹猴D17类胚胎的单细胞转录组分析和发育路径分析。 

图2. 非人灵长类类囊胚体外重构和体内外发育潜能研究模式图。