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6+免疫热点趋化因子套路拆解!热门文献教你零代码复现

6+免疫热点趋化因子套路拆解!热门文献教你零代码复现

公众号新闻

各位小伙伴大家好,我是灰灰,本期复现的文献所涉及的是备受高分杂志关注的热点方向——趋化因子,这篇文章是2022年7月发表在影响因子6+医学杂志Am J Cancer Res上生信文章~

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文章题目

02

文章背景

趋化因子也称为趋化性细胞因子,是一类小分子(8到10 kDa)分泌性蛋白,由于它们具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力,因而命名为趋化因子。其功能主要是在稳态和炎症状态下指导细胞迁移,即表达趋化因子受体的细胞向趋化因子高浓度的区域迁移。目前趋化因子根据位于 N 末端的保守半胱氨酸残基的数量和位置,将这些蛋白分为四个亚家族:C 趋化因子,CC 趋化因子,CXC 趋化因子和 CX3C 趋化因子亚家族,所有这些蛋白都通过与趋化因子受体相互作用来发挥其生物学效应。在不同类型的趋化因子中,CXC趋化因子在肿瘤发生中的作用最为显著。

尽管目前发现一些趋化因子/趋化因子受体(CCRs)在胃癌(GC)中存在差异表达,且其表达与不良预后的相关,但大多数CCRs在GC进展中的作用尚未见报道。因此,当前研究中作者首先分析了CCRs突变的特征并筛选差异表达的CCRs,通过GO功能注释和KEGG通路分析,探讨其潜在的生物学功能;通过多因素Cox回归分析,构建预测模型并绘制列线图来评估胃癌患者的预后。此外,作者对高、低风险组胃癌患者也进行GSEA和GSVA分析,并分析了风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性。

PS:原文中作者并没有详细描述63个CCRs的来源,这里以文献A guide to chemokines and their receptors[PMID: 29637711]中的64个CCRs进行复现。


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文章思路

  • 差异表达

  • Figure 1:TCGA-STAD数据集中CCRs突变情况

  • Figure 2:TCGA-STAD数据集中CCRs的表达水平

  • Table 1:Top 24 CCRs的表达

  • Figure 6:ACKR3、CCR3和CCL21的免疫组化和qPCR分析

  • 功能聚类

  • Figure 3:top 24 CCRs的富集分析

  • 临床意义

  • Figure 4:CCRs对胃癌患者的预后价值

  • Table 2:构成预后模型的四种CCRs

  • Figure 5:预后风险模型的列线图

  • Table 3:胃癌患者的总生存期进行单因素分析

  • Table 4:胃癌患者的总生存期进行多因素分析

  • Figure 7:风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性

  • Figure 8:不同危险组的不同信号通路富集

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文章复现

  • 使用工具

仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/)

GSCA数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/)

Networkanalyst数据库(https://www.networkanalyst.ca/)

metascape数据库(http://metascape.org/)

HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org/)

TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)

  • 复现步骤

Figure 1:TCGA-STAD数据集中CCRs突变情况

PS:原文Figure 1突变分析涉及maftools包,这里感兴趣代码的小伙伴可以参考阿琛老师的推文《想让文章拥有如此漂亮的患者突变可视化图?“maftools“包帮你解决》进行学习,这里我们借用GSCA数据库进行复现

进入GSCA数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/),左侧导航栏中选择Mutation,检索框中输入CCRs,选择胃癌STAD,下方分析勾选SNV summary,点击Search

待分析完成后可得到胃癌中趋化因子的突变概况图和突变Top10的瀑布图,点击右上方红色下载图标即可下载PDF图片

Figure 2:TCGA-STAD数据集中CCRs的表达水平

‍‍‍

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择表达差异(挑)[云]非配对样本→选择TCGA-STAD的TPM格式的数据集,分子栏输入CCRs,默认其它参数,点击确认,即可得到CCRs在TCGA-STAD中的表达箱式图

点击结果情况下方的表格下载,即可得到CCRs的在胃癌以及正常组织中的表达均值等

点击数据下载栏中的百度云超链接,即可下载TCGA-STAD的TPM格式的RNAseq数据。

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择基础绘图中简易ID转换(人源)→上传步骤(1)中下载的数据ID,点击确认,最终转换结果如下

 

提取64个CCRs基因的表达矩阵如下:

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择基础绘图中复杂数值热图[上传]→上传CCRs的表达矩阵,默认其它参数,点击确认,即可得到CCRs的热图

Table 1:Top 24 CCRs的表达

将64个CCRs基因的表达矩阵整理为如下格式
进入Networkanalyst数据库(https://www.networkanalyst.ca/),点击左下角Gene Expression Table

选择物种H.sapiens(human),Data type为Microarray data,ID type为Official Gene Symbol,Gene-level summarization为Mean,上传整理好的CCRs表达矩阵,点击Submit,运行完成后点击右下方proceed

弹出的界面默认相关参数,点击Submid,运行完成后点击右下方proceed

点击Download即可下载得到差异分析结果

提取LogFC和P-value,与Figure 2中步骤(1)下载的CCRs的在胃癌以及正常组织中的表达均值汇总,即可得到文中Table 1

Figure 3:top 24 CCRs的富集分析

进入仙桃学术工具,点击左侧导航栏中的功能聚类(圈)GOKEGG(联合logFC)富集分析,上传差异CCRs及其对应的LogFC,富集分析类型分比选择全部GO+KEGG,点击确认,待分析完成后,分别名保存结果为GO+KEGG,并下载EXCEL结果

 

进入仙桃学术工具,点击左侧导航栏中的功能聚类(圈)→ GOKEGG(联合logFC)→圈图,点击上方刚刚分析好的云数据,基本参数输入显示的GO/KEGG富集条目,点击确认保存即可得到GO/KEGG富集分析圈图

PS:这里也可以选择柱状图、气泡图、弦图

进入metascape数据库(http://metascape.org/),输入差异CCRs,点击submit,物种选择H.sapins,点击Express Analysis,待分析完成后点击Analysis Report pages

弹出的结果界面中,Figure2和Figure 3分别为文中Figure3C和Figure3D,点击PDF图标即可下载图片,也可下载CYS格式,随后在cystocope中进一步美化

Figure 4:CCRs对胃癌患者的预后价值

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择预后分析中临时[云]单因素/多因素Cox回归→选择TCGA-STAD数据集,输入差异表达的CCRs,默认其它参数,点击确认,即可得到CCRs在胃癌中的单因素/多因素Cox分析结果,分别点击EXCEL和Riskscore保存

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择基础绘图中的森林图→上传步骤(1)中得到的单因素结果,默认其它参数,点击确认,即可得到得到单因素的森林图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择预后分析风险因子图→上传Cox回归分析保存的Riskscore文件

默认相关参数,点击确认,即可得到文中Figure 4中的风险因子图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择表达差异(挑)复杂热图(上传)→上传Cox回归模型中CCRs的表达矩阵,同时按照RiskScore进行中位数将其分为高低风险组,默认其它参,点击确认,即可得到文中高低风险组表达热图

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择基础绘图生存曲线-二分类/数值/单组→上传Cox回归分析保存的Riskscore文件

默认相关参数,即可得到文中高低风险组的预后生存曲线

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择基础绘图时间依赖性ROC→上传Cox回归分析保存的Riskscore数据,预测年限调整为5年,默认其它参,点击确认,即可得到时间依赖性ROC

Figure 5:预后风险模型的列线图

PS:关于列线图模型的构建,一方面可以用Cox回归模型中CCRs的表达联合临床变量构建,另外也可以用Cox回归分析后得到的Riskscore联合临床变量

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择预后分析中[云]预后列线图→选择TCGA-STAD数据集,输入临床变量以及预后相关的CCRs,预测年限调整为1年、3年、5年,默认其它参,点击确认,即可得到预后CCRs的表达联合临床变量构建的列线图

 

点击下方数据下载里面原始临床数据+RNAseq编号对应的百度云超链接,下载相应的临床数据

提取相关临床变量,同时匹配Cox回归分析后得到的Riskscore列,最终整理格式如下

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择预后分析预后列线图上传→上传整理好的上方数据,输入临床变量以及预后焦亡基因,预测年限调整为1年、2年、3年,默认其它参,点击确认,即可得到Riskscore联合临床变量构建的列线图

Table 3/4:胃癌患者的总生存期进行单因素/多因素分析

进入仙桃学术工具(https://www.xiantao.love/),左侧导航栏中选择预后分析单|多因素Cox回归-上传→上传列线图数据,默认其它参数,点击确认,即可得到各个变量在胃癌中的单因素/多因素Cox分析结果

Figure 6:ACKR3、CCR3和CCL21的免疫组化和qPCR分析

进入HPA(https://www.proteinatlas.org/)数据库,在检索栏输入基因ACKR3后点击Search

弹出界面分别选择Tissue和Pathology

Tissues选择STOMACH,即可得到文章中Figure 6A的Normal图片

CANCER选择STOMACH CANCER,即可得到文章中Figure 6B的Tumor图片,

同样操作步骤即可获取其它CCRs在胃癌和正常组织的免疫组化图

Figure 7:风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性

PS:原文中通过R包分析了风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性,这里我们也可以零代码替换成预后CCRs和免疫细胞的相关性

进入TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/),导航栏中选择Gene,Gene Symbol输入预后CCRs CXCR1,Cancer Types中输入STAD,Immune Infiltrates默认B cell,CD8+ T cell,CD4+ T cell,macrophage,neutrophil ,dendritic cell ,点击Submit,即可得到胰腺癌中焦亡基因CXCR1与多种免疫细胞的关系

Figure 8:不同危险组的不同信号通路富集

 

PS:对高低风险组进行的GSEA富集分析,这里可以重复利用Networkanalyst数据库对高低风险组进行差异分析(具体步骤可参见前方Table 1的复现内容),分析后提取所有基因及其对应的LogFC即可进行GSEA富集,这里我们以仙桃学术进行演示

进入仙桃学术工具,点击左侧导航栏中的功能聚类(圈)GSEA富集分析,上传高低风险组差异分析结果中的所有基因及其对应的LogFC,默认其它参数,点击确认

进入仙桃学术工具,点击左侧导航栏中的功能聚类(圈)GSEA富集GSEA可视化,点击上方刚刚分析好的云数据,基本参数输入显示的GSEA富集条目,点击确认保存即可得到GSEA图

PS:GSVA分析目前尚无法零代码完成,这里让我们期待一下升级版本的仙桃

好啦,以上就是本次趋化因子生信文献复现分享的全部内容啦,愿屏幕前的你学有所获,下期再见,886


END



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