PNAS | 中国科学院王艳丽团队揭示一种噬菌体抵抗宿主防御的机制

2023-08-14 00:08

抗CRISPR ( Acr )蛋白由噬菌体和其他可移动遗传元件编码，通过多种策略抑制宿主的CRISPR-Cas免疫。AcrⅡC4是一种广谱的Acr，在多个物种中以未知的机制抑制Ⅱ- C型CRISPR-Cas9系统。

2023年7月26日，中国科学院生物物理研究所王艳丽团队在PNAS 上在线发表题为“AcrIIC4 inhibits type II-C Cas9 by preventing R-loop formation”的研究论文，该研究确定了HpaCas9-sg RNA与AcrⅡC4和/或靶标DNA复合物的一系列结构，以及AcrⅡC4单独的晶体结构。该研究发现AcrIIC4位于HpaCas9的REC1和REC2结构域之间的缝隙中，其广泛的相互作用限制了REC2结构域的移动并阻止了PAM-远端目标双链( ds ) DNA的解旋。

因此，在AcrⅡC4存在的情况下，全长向导RNA使得目标DNA异源双链不能形成，并阻止了Cas9核酸酶的激活。总之，结构和生物化学研究阐明了一种独特的Acr机制，它允许DNA与Cas9效应复合物结合，但通过阻止R-loop的形成来阻止其切割，这是支持Cas9切割DNA的关键步骤。

细菌和它们的病毒(噬菌体)之间的协同进化是一场军备竞赛，防御和反防御系统的武器库不断扩大。原核生物利用限制修饰( R-M )系统、CRISPR - Cas系统、流产感染等多种防御系统来中和入侵的噬菌体。相应地，噬菌体采取不同的策略来颠覆宿主防御系统，包括突变DNA或蛋白质靶标，化学修饰，甚至将其DNA基因组包裹在一个蛋白质类的、类似细胞核的隔室中，以逃避宿主的攻击。

在所有这些抗病毒系统中，CRISPR-Cas系统作为一种在古细菌和细菌中发现的适应性免疫系统是独一无二的。它们可以通过RNA依赖的方式破坏入侵者的基因组，包括噬菌体、质粒和其他可移动遗传元件( mobile genetic elements，MGEs )。为了防御外来核酸，CRISPR - Cas系统从入侵者中捕获短的DNA片段，并将其插入到CRISPR阵列中，从而记录潜在威胁的遗传快照。随后，CRISPR位点被转录和加工，生成CRISPR RNA ( crRNA )，当入侵者返回时，cr RNA结合并引导Cas蛋白效应复合体切割入侵者的基因组。为了对抗CRISPR-Cas系统，噬菌体进化出许多小蛋白来拮抗CRISPR - Cas系统，称为抗CRISPR蛋白( anti-CRISPR proteins，Acrs )。Acrs通常为50 ~ 150个氨基酸，可以通过多种机制抑制Cas蛋白。

自2013年在一株铜绿假单胞菌的前噬菌体中发现第一套针对I - F型CRISPR - Cas系统的Acrs以来，已经鉴定了50多个Acrs，并对其中的一个子集进行了机制和结构研究。从机理上讲，可将Acrs分为两类。一组Acrs直接与Cas蛋白相互作用，诱导Cas蛋白或cr RNA的降解，阻止crRNA装载，阻止DNA识别，阻断核酸酶结构域，或限制Cas蛋白的构象激活。相比之下，另一组Acrs不结合Cas蛋白，而是通过酶促方式发挥作用；例如，通过对Cas蛋白的关键残基进行抑制性修饰，降解Ⅲ型CRISPR系统的第二信使cA4，或者作为切口酶解旋超螺旋底物使其不易被Cas9切割。

Acrs已被开发为控制CRISPR - Cas系统的基因组编辑和其他生物技术应用的有用工具，阐明Acrs的分子机制对未来的工具开发很重要，也可以为Cas蛋白提供新的机制见解。有趣的是，Acrs抑制II - C型Cas9亚型，因为这些系统在Cas9分支内具有相对较小的尺寸和高保真度，使它们成为基因组工程的重要效应因子。迄今为止已经鉴定了5个抑制II - C型CRISPR - Cas9系统的Acr蛋白，命名为AcrIIC1 - 5。

HpaCas9-sgRNA-AcrIIC4三元配合物的整体结构（图源自PNAS ）

AcrⅡC4最初在副流感嗜血菌( Hpa )中被鉴定，已报道了2个游离AcrⅡC4的晶体结构。在一个结构中，AcrⅡC4是由一个四螺旋束组成的单体。相比之下，另一个结构显示AcrIIC4是一个同源二聚体，每个单体由一个长和两个短的α -螺旋组成，与单体结构的排列方式截然不同。除了结构上的模糊性，AcrⅡC4的作用机制也不清楚。之前的两项工作通过电泳迁移率变动分析( EMSA )表明AcrⅡC4通过阻止靶DNA结合来抑制Cas9活性，而最近的一项研究表明DNA结合并没有被阻断，反而提示AcrⅡC4可能抑制DNA结合后HNH核酸酶结构域的移动。

该研究测定了游离AcrⅡC4、HpaCas9 - sgRNA - AcrⅡC4三元复合物和HpaCas9 - sgRNA - DNA三元复合物的晶体结构，以及HpaCas9 - sgRNA - AcrⅡC4 - DNA四元复合物的冷冻电镜结构。结构和生物化学研究表明，AcrIIC4是一种在溶液中具有长柔性螺旋的单体，可以通过其中间区域的弯曲从延伸构象转变为紧凑构象。AcrⅡC4与HpaCas9的REC叶结合，并不取消HpaCas9与DNA的结合，而是限制REC2结构域的运动，阻断PAM -远端dsDNA的解旋，阻止可容纳向导RNA ( Guide RNA，gRNA )：靶链( Target strand，TS )异源双链的结合通道的形成。总之，该研究证实了AcrIIC4阻止完整R - loop的形成，这是Cas9靶向Acrs抑制的独特机制。此外，AcrIIC4对HpaCas9的抑制作用强于脑膜炎双球菌Cas9 ( NmeCas9 )，其原因是NmeCas9的同源sgRNA茎环1的长度比HpaCas9的长。

中国科学院生物物理所孙伟副研究员(第11批会员)为第一作者，，研究工作得到国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项（B类）和中国科学院青年创新促进会等的支持。生物物理所生物成像中心和科学研究平台分别为电镜数据收集和静态光散射实验提供了技术支持。

参考信息：https://doi.org/10.1073/pnas.2303675120

来源：iMedicines

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