Nat Commun | 我国科学家开发出微型化的Cas13，有望简化基因编辑

CRISPR-Cas 在治疗和治愈人类疾病方面大有可为。科学家们可以通过腺相关病毒（AAV）载体将CRISPR元件导入大量哺乳动物细胞，这是为数不多的方法之一。AAV载体很小，因此很难将大型 Cas 酶基因及其启动子、多聚腺苷酸化信号、向导RNA（gRNA） 基因和其他所需元件装入同一个载体中；将这些组分装入两个载体中可能会造成剂量问题或降低效率。

将所有组分装入同一个AAV载体的一种方法是将较大的Cas酶基因缩小。在一项新的研究中，中国吉林大学遗传学者李占军教授和他的课题组通过剔除不必要的部分，将Cas13d酶微型化，然后利用一种名为AlphaFold2的人工智能平台可视化观察其他的Cas13d和Cas13b酶的结构，并将它们微型化。他们发现这些微型化的酶和它们的野生型酶一样有效。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“A strategy for Cas13 miniaturization based on the structure and AlphaFold”。

华盛顿大学遗传学者Jeffrey Chamberlain（未参与这项新的研究）说，“没有多少例子表明，蛋白可以缩小到更小的尺寸，但仍能发挥作用。就通过使用这些AAV递送工具简化基因编辑而言，这可能具有巨大的意义。”

过去，科学家们曾寻找并发现了天然的更小的 Cas 蛋白（Nature Biotechnology, 2022, doi:10.1038/s41587-021-01030-2），但这些蛋白的性能并不总是像全尺寸的 Cas 蛋白那样好。目前还没有开发出有效的、可推广的将 Cas 蛋白变小的方法。

李占军课题组使用了一种他们称之为“相互作用、动力学和保守（Interaction, Dynamics, and Conservation, IDC）”的策略，找到了Cas13d酶中对它的功能并非必需的部分。（Cas13是CRISPR中使用的多种Cas酶之一，但它的靶标是RNA，而Cas9的作用靶标是DNA）。

他们首先研究了一种名为 EsCas13d 的 Cas13d 蛋白。之前的研究已经利用低温电镜确定了这种蛋白的晶体结构，因此他们利用 IDC 策略研究了 EsCas13d 酶功能位点之间的相互作用、酶执行功能时发生的构象变化以及保守和通用的结构单元。他们选择了八段氨基酸链，他们假设这些氨基酸链对EsCas13d的功能不是必需的，并剔除它们，从而构建出微型化的EsCas13d，即mini-EsCas13d。

接下来，他们使用 AlphaFold 根据氨基酸链预测了 Cas13d 另外两个成员 RfxCas13d 和 RspCas13d 的结构。他们发现这两个成员的结构与EsCas13d相似（但有一些关键差异），于是他们开始用同样的方法将它们微型化。

李占军教授发现，每种微型化的Cas13d都能敲除HEK293细胞系中多个基因的RNA，其效率水平、最佳间隔序列长度、错配耐受性和脱靶效应与野生型的Cas13d大致相同。Western 印迹分析表明，野生型Cas13d和微型化的Cas13d在细胞中也显示出相似的蛋白水平。他们随后尝试使用 AlphaFold2 和 IDC 策略将 Cas13b 微型化，并构建出它的两种剔除12 个氨基酸片段的微型化变体，每种变体的靶向降解RNA的水平都与野生型Cas13b相同。

图片来自Nature Communications, 2023, doi:10.1038/ s41467-023-41320-8。

为了了解这些微型化的Cas13酶是否能在体内发挥作用，李占军课题组利用它们靶向能提高血液胆固醇水平的小鼠Pcsk9。他们将含有靶向Pcsk9 mRNA编码序列的crRNA的mini-RfxCas13d AAV质粒注射到8周大小鼠的尾静脉中，注射后小鼠体内Pcsk9的mRNA水平显著下降，Pcsk9蛋白水平也随之下降。李占军教授在一封电子邮件中证实，“这些微型化的Cas13蛋白表现出与野生型Cas13相似的完全活性，这些接受AAV注射的小鼠的血清总胆固醇水平降低到正常水平的61%+8.3%。”它们的肝损伤指标正常，肝脏看起来很健康。

李占军教授说，“下一步计划是设计更合理的蛋白，不仅包含微型化，还包含添加、替换和突变，以获得高保真、超精确和高效的Cas蛋白。”

Chamberlain说，“这样做的好处是，他们结合了人工智能和多种学习到的特征，真正对蛋白结构进行了细致入微的分析。我希望类似的研究工作也能应用到其他的一些Cas酶上，比如Cas9，它是更常用的基因编辑酶，它靶向DNA而不是RNA。”

参考资料：

Feiyu Zhao et al. A strategy for Cas13 miniaturization based on the structure and AlphaFold. Nature Communications, 2023, doi:10.1038/ s41467-023-41320-8.

The Wonderfully Shrunken Cas13
https://www.the-scientist.com/news/the-wonderfully-shrunken-cas13-71467