激光扫描共聚焦显微镜在生命医学研究中广泛应用，通过共聚焦显微镜获取的图片可进行共定位分析。生物学上荧光共定位（Colocalization）指两个或多个不同分子位于细胞中的同一结构，常用来研究两个荧光分子在组织或者细胞中的位置关系以及可能存在的相互作用。
共定位图像包含了丰富的信息，但对图像数据的视觉解释只能定性，难以描述其统计学意义，且存在遗漏潜在信息的可能。因此需要使用软件对共定位图像进行系统的分析。今天半夏就给大家分享使用ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）进行系统荧光共定位分析的实用技能！在荧光共定位分析前先给大家分享共定位分析的前期准备工作：图像应以顺序扫描方式获取以消除荧光的交叉干扰和确保共定位的可靠定量，并以Tiff格式进行保存防止信息丢失。
考虑多种因素，包括免疫荧光的强度和共聚焦用于获取图像的模式；为了获得定量结果具有可比性，同一研究中的所有图片应该保持一致。有报道称背景校正的图像可能会导致高达30%的共定位过高估计。
ScatterJ是一款基于Java的免费、专业多图像处理ImageJ插件，该插件可用于各种不同的二维（2D）和三维（3D）图片分析。对于共聚焦图像分析而言，ScatterJ集成了许多强大和实用的辅助功能，可以简单快捷地实现共聚焦散点图绘制、相关性分析等。ScatterJ下载链接：http://download.savannah.gnu.org/releases/scatterj/。下载解压后，将ScatterJ_.class文件移动到ImageJ安装目录的Plugins文件夹中，重启ImageJ即可在Plugins下拉菜单中找到ScatterJ。下图为ScatterJ的基本操作界面：下图是SCI文献中出现最多也是最基本的荧光共定位分析方法：我们可以使用ImageJ的Plot Profile工具实现上述分析。（1）File -＞ Open打开需要分析的荧光图片（2）对于RGB图片，可通过Image -＞ Color -＞ Split channels将各通道分开。如果在拍摄时涉及红绿蓝以外的通道，推荐将各通道分开保存。因为无论图像原本有多少通道，ImageJ也只能拆分出红绿蓝三通道。（3）Image -＞ Stacks -＞ Images to stack，将多幅图像变成图像栈。（4）选择工具栏中的直线工具（Line）或矩形工具（Rectangluar），选定图像栈中感兴趣的区域，Analyze＞Plot profile，弹出的图像中，横轴代表线上各像素点，纵轴为各点对应的灰度值；因此图像代表了灰度的变化趋势。点击live使结果图与图像栈中的图像相对应。对比各通道结果图可以大致了解共定位情况，根据需要可以将数据导出Excel重新绘图。（5）通过Plot Profile分析的一个好处是可以直观地看到图像拍摄的曝光情况。当图像过曝时，灰度值的峰会超过最大值灰度值255，导致图像顶端变成平的。过曝会导致原本可能存在差异的灰度信息丢失。如果离最大灰度值较远说明曝光过浅，过浅也可能导致信息的丢失。Plot Profile进行共定位分析的缺点是不能对共定位进行定量描述，因此需要进行进一步的定量分析。（1）Colocalization Finder插件分析共定位下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html，安装方法与ScatterJ相同。
步骤：
（1.1）打开待分析图片：
（1.2）Image -＞ Color -＞ Split channels拆分荧光通道：（1.3）Plugins -＞ Colocalization Finder分析红绿通道共定位情况：得到共定位散点图，散点图越接对角线共定位程度越高：散点图颜色的深浅代表其出现的频率，Plugins -＞ 3D -＞ Interactive 3D Surface Plot可以直观的显示：除散点图外Colocalization Finder还可以得到定量数据：Pearson’s相关系数（PCC），两通道之间的强度分布关系；Manders重叠系数（MOC），共定位的真实程度；重叠系数k1和k2，共定位系数m1和m2，共定位系数M1和M2，每个特定抗原对于共定位区域的贡献度。如果一种染色强度大于另一种，MOC的共定位系数更加可靠。ImageJ打开荧光图片，Plugin -＞ Colocalization Finder分析红绿通道共定位情况。在Tumor_cells红色荧光通道上显示共定位像素，会在Image3上显示为绿色：Image -> Type将共定位像素图片由RGB转换为HSB Stack图片，饱和度（Saturation）图片对应共定位像素，Image ->Adjust Threshold选中共定位像素后续测量面积即可。方法为打开层扫荧光图片在ImageJ主菜单上点击Image -> Stacks -> Orthogonal views，即可显示XY,XZ,YZ视图，XY视图中的黄色十字可以用鼠标拖动。共定位散点图可以直观和定量地描述共定位程度。在ScatterJ中可以方便地实现散点图地绘制。（4.1.1）图像导入：ScatterJ要求被导入的图像必须为相同尺寸的8位灰度格式图片，且各图间的像素点应是严格对应的。如有必要图像导入前可进行去背景处理。对于叠加后的多通道图像，我们可以直接通过图像拆分（Image ＞ Color ＞ Split channels）得到符合导入要求的一组图像。（4.1.2）绘制散点图：Plugins ＞ ScatterJ ＞Create scatterplot＞stack1和2中选择需要分析的通道：散点图的横轴和纵轴分别带别每个像素点在各通道得到的灰度值，因此图像越接近对角线，表示共定位程度越高。（4.1.3）点击Axes，在Define axes中可自定义坐标轴、命名坐标轴标题等。calibration factor x（y）校准系数可以将每个轴8位灰度值转换成有意义的单位。从而使用有意义的单位而不是使用灰度值进行分析。对于免疫组化图像，如果需要根据光密度值换算成分浓度，即可通过此功能实现。Colour scale＞Define colours可根据自己的需要改变散点图颜色分布，使图像更加美观。ScatterJ提供了三种不同的回归方法，包括最小二乘（ordinary least squares）、长轴回归法（major axis，MA）和简化长轴回归法（reduced major axis regression）勾选Pearson’s coefficient可在结果中显示Pearson相关系数。Pearson可以定量表述两个连续变量间线性关系的密切程度和相关方向。其数值介于-1到1，取值越接近0，变量间相关性越低；取值接近1或-1，则相关性越强。正负号代表相关的方向，为正相关或者负相关。输出的结果包括计算出的回归线和Pearson相关系数。除了将回归线绘制到散点图中外，对于MA回归，ScatterJ还允许计算和绘制假设的双变量正态分布的短轴(即垂直于MA的轴)和95%置信椭圆。Backmapping工具可根据散点图中的点回溯到输入图像中对应的像素点。如果对共定位散点图中某个区域感兴趣，如散点图中标出的分叉的部分，可通过ROI工具对其进行选择，点击backmapping进行回溯，即可在原始输入图片中显示对应像素点。为了方便分析，可通过Image＞colour＞merge channels将结果图与单通道图像叠加，由于荧光图是伪彩图，我们可以根据需要选择通道的颜色，使得叠加后的图像更加美观和易于观察。Deviation maps工具会计算每一个像素点在散点图中与参考线的距离，并以不同的颜色标注出来。这里的参考线可以是计算得到的相关性回归线，也可以是用户自定义的。可根据不同的需要选择计算水平距离、垂直距离、水平和垂直距离的几何平均数或者角度距离（数据点和参考线的位置向量包围的角度）。如果以计算得到的回归线为参考线，可以先点击Statistics完成数据分析，再进入Deviation map，系统会自动将回归线相关数据输入Deviation map菜单中。在许多情况下，尽管共定位散点图总体呈线性趋势，但点群仍会存在一定程度的扩散。通过Deviation maps工具生成的偏差图，我们可以分析这样的扩散是由实际的差异造成的，还是仅仅由统计差异造成。如图，偏差图中随机分布的颜色表示纯粹的统计学差异。白色为背景。如果出现某一颜色的集中富集，说明像素群的扩散是由样本中的成分变化造成的，如图中红色区域。这样的信息在原始图像中是很难发现的。ScatterJ在一个插件中整合了散点图绘制、图像优化、Backmapping工具和Deviation map工具等许多功能，不但非常方便，还有助于挖掘原始共定位图像中难以发现的信息，非常适合荧光共定位图片的定量分析。下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html。Coloc 2集成了以往共定位分析的插件的诸多功能，下载及详尽说明如下：https://imagej.net/Coloc_2。(1) 打开待分析图片：
(2) Image -＞ Color -＞ Split channels拆分荧光通道：(3) Analyze -＞ Colocalization -＞ Coloc 2，选好待分析Channel，算法都勾选上，点击OK。
需要提醒大家注意的是上图结果中Threshold是指对图片的灰度设定一个阈值，高于多少才能被计算，目的是降低背景。如果图片中物体与背景区分明显，可以很好进行Threshold，建议用above threshold的值。
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