面向未来，基因编辑结合血细胞重编程开发临床新方法
诱导性多能干细胞（iPSC）是一种通过导入特定的转录因子将体细胞重编程获得的多能性干细胞。iPSC可以体外培养、扩增、分化为不同的细胞类型，解决了长久以来利用胚胎干细胞（ESC）研究疾病的伦理问题，成为研究疾病治病机制、筛选个性化药物、细胞治疗的有力工具。由赛默飞世尔推出的干细胞“飞”凡有约系列访谈，旨在从干细胞各研究应用领域的专家视角出发，探寻不同干细胞研究领域的最新发展趋势，助推科研发展之路。
2020年10月7日，诺贝尔化学奖被授予德国埃马纽埃尔·沙尔庞捷教授和美国珍妮弗·杜德纳教授，获奖评语如下：以表彰她们发现CRISPR-Cas9基因组编辑方法。这一被誉为“基因魔剪”的技术极大加速了研究人员对于基因编辑的研究。简单便捷的操作使得CRISPR-Cas9基因编辑技术迅速在生物医学各个领域应用开来，并成为研究人员开展基因和表型研究的利器。
而当基因编辑技术遇到干细胞疗法时，又会发生什么样的神奇裂变呢？
在赛默飞世尔科技举办的《干细胞“飞”凡谈系列空中讲坛》第三期“聚焦产学研，共话iPSC在细胞治疗中的应用与产业化发展”中，特别邀请了中国医学科学院血液学研究所张孝兵教授和张健萍副研究员针对“高效血细胞重编程和iPSC基因编辑”进行了主题报告。
张孝兵教授
张孝兵，男，博士生导师，细胞生态海河实验室领军科学家，协和医学院兼职特聘教授，美国罗马琳达大学兼职副教授。2022年入选中组部某人才计划。1999年博士毕业于华东理工大学，同年赴香港中文大学开展造血干细胞HSC研究。2002年起在美国Fred Hutchinson肿瘤研究中心从事基因治疗研究。2009年受聘于罗马琳达大学任助理教授、副教授。2014年受聘为实验血液学国家重点实验室兼职研究员。2022年受聘为细胞生态海河实验室领军科学家。过去25年，主要从事HSC、多能干细胞iPSC和基因治疗研究。开发的iPSC重编程载体和HDR基因编辑载体已经被全世界数百家实验室和公司使用。在国际学术期刊发表80余篇论文，申请中美专利20余项。其他贡献包括：1）发明了一种干细胞储存配方；2）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术治愈血友病；3）建立一系列基因治疗质控方法，包括Off-Target脱靶切割和大片段删除检测，慢病毒和AAV载体的全序列测定等。
张健萍，中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），副研究员，硕士生导师，天津市“131”创新型人才培养计划第三层次人选。2013年博士毕业于清华大学，同年入职中国医学科学院血液学研究所，任助理研究员、副研究员。2018年至2020年作为访问学者赴美国罗马林达大学医学中心交流。过去10年，主要从事多能干细胞iPSC和基因治疗研究。在学术期刊发表20余篇论文，申请中美专利10余项。主要贡献包括：1）开发出高效iPSC重编程载体，将血细胞重编程效率提高100倍；2）开发HDR基因编辑载体，基因编辑效率提高2-10倍；3）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术治愈血友病。作为课题负责人主持国家自然科学基金青年和面上项目各1项，作为研究骨干参加科技部重大科学研究计划、重点研发计划和基金委重点项目多项。
张孝兵教授和张健萍副研究员长期从事造血干细胞扩增、血细胞重编程和基因治疗研究，并在在Nature Medicine、Plos Medicine、PNAS、JCI、Cell Research、Genome Biology、Nucleic Acids Research等国际知名学术期刊发表了一系列相关研究论文。
在此次报告之后，我们针对观众比较感兴趣的问题以及目前干细胞疗法存在的一些问题，与张孝兵教授和张健萍副研究员进行了互动问答：
Q
请问目前血细胞重编程技术的难点在哪里？
A
张健萍老师：目前来说，血细胞重编程技术的开展在我们实验室是比较简单的，但是如果推广到其他实验室，我觉得目前的难点可能是重编程方法的选择。不恰当的重编程的方法可能会导致重编程效率比较低。简单介绍一下我们实验的工作，我们实验室在张孝兵教授的指导下，利用 Episomal载体不断更新重编程技术，发展了一套成熟且高效率的血细胞重编程技术，比如说我们选择了在血细胞中高表达的SFFV启动子，并通过加入抗凋亡蛋白，减少血细胞在电转过程中的死亡；此外，我们还优化了重编程因子的组合，这些方式都将血细胞重编程的效率提高了10~100倍，所以目前在我们实验室这个技术还是比较简单。
Q
基因编辑技术的类别有很多，您为什么选择基于HDR的基因编辑技术开展血细胞编辑？
A
张孝兵老师：你所提到的不同的基因编辑技术类别，应该指的是不同类型的Cas9蛋白、还有这几年比较火的单碱基编辑器和引导编辑器等技术。这些不同的基因编辑技术都有其特定的应用场景，比如碱基编辑器适用于单碱基的替换；引导编辑器可以实现一些短片段的插入或者删除，效率也不错，但是如果要进行大片段的插入目前效率还比较低。而基于同源重组的HDR编辑可以实现大片段的插入，最长可以达到4-5kbp的精确编辑。
张健萍老师：目前来说，我们所开展的基因编辑主要是在iPSC以及血细胞，比如T细胞和造血干细胞等。基于HDR的基因编辑使用的是同源重组的方法，在很多基因编辑应用中的是很重要的。比如在疾病治疗的过程中，使用HDR的方法可以对致病基因进行精准修复。在我们研究之初，通过HDR形式对iPSC进行基因编辑的效率是非常低的，经过多年的努力，目前我们已经将HDR基因编辑效率提高了数十倍，为其下一步临床应用奠定了基础。我们相信，HDR编辑有广阔的应用前景。
Q
基于HDR的基因编辑目前应用到临床还有哪些困难需要克服？
A
张孝兵老师：在离体细胞编辑方面，目前的主流临床应用路径就是体外进行iPSC基因编辑，敲入CAR元件，然后进行后续的定向分化和临床研究。对于在体基因编辑，目前最大的问题是编辑效率比较低，对于相当一部分的临床疾病，编辑效率至少要达到10才才有显著的疗效。另外，需要关注安全性，要防止基因编辑的脱靶效应，减少载体随机插入等。
Q
目前的血细胞重编程技术距离临床应用还有哪些需要克服的问题？
A
张孝兵老师：血细胞重编程技术应该已经比较成熟，并且可以用于临床应用。目前来说，我们开发血细胞重编程技术应该是比较先进的，但是由于过去我们没有宣传，因此国内同行不太了解。我们这套血细胞重编程载体系统的效率远远高于很多实验室还在使用的早期开发的Episomal系统。此外，最近几年我们还花了大量时间来做质量监控，并建立了成熟的质控体系。对于iPSC的临床应用研究，需要一定的经验，国内许多做iPSC的公司，由于没有足够的技术积累，因此会觉得开展临床应用很难。所以，对于我们在血细胞重编程技术方面积累了20年研究经验的团队来说，技术方面已经不存在问题。但是推广到临床应用只有干细胞培养技术是不行的，还需要基因编辑、高通量测序，细胞生物学等多方面的人才共同努力来推动iPSC的临床转化。
张健萍老师：目前血细胞重编程技术走向临床应用最大的问题也是对其安全性的担忧。因为 iPSC细胞在起始细胞选择，培养和诱导分化过程中都会产生基因突变，这个过程我们就需要关注如何能保证获得更加安全的iPSC。首先，在诱导的过程中，应当选择突变更少的起始细胞，比如我昨天报告里提到的造血干祖细胞，外周血单个核细胞，用这些突变比较少的细胞作为iPSC重编程细胞的来源。另外，使用高效的重编程方法，可以大大降低恶性增殖细胞被筛选出来的概率。最后还有一点，我昨天在报告里边也有提到，在对 iPSC培养过程中，选择低氧培养的方法，减少外界刺激，以及在传代过程中用聚团传代的方法，这些都可以尽量减少基因变异，提高iPSC临床应用的安全性。
Q
如果要进行血细胞在体编辑，其主要问题有还有哪些？
A
张孝兵老师：在体外培养中对血细胞进行编辑，很容易对各方面指标进行检测质控评估，而在体内则较难进行。其次，我们在体外可以通过电转进行高效率转染，而在体内则无法使用电转。这也是制约血细胞在体编辑最大的问题，效率较低。再次，就是被编辑细胞的选择性，比如现在使用的CAR-T细胞一般都是在体外进行编辑，然后回输进入患者体内。如果有一天可以实现在体编辑T细胞，就可以直接在体外制备自体CAR-T细胞，而无需体外操作，从而大大降低治疗费用。如果我们能在体实现对造血干细胞的高效率编辑，则可以治疗许多临床疾病，意义重大。最后，就是保证在体编辑的安全性，提高靶向性，降低在体编辑的脱靶几率。这些都是未来需要努力的方向。
Q
目前来说，您觉得如果基因编辑要走向临床，编辑效率至少应该达到多少？
A
张孝兵老师：对于某些疾病，1%的在体编辑效率就可以进行有效治疗，但是对于多数疾病来说，最好要达到10-20%。20%以上通常就可能恢复到同正常人一样的生活，如果有10%的效率也能够得到相当的改善，比如地中海贫血，如果造血干细胞在体编辑能够达到20%的话，几乎就被完全治好了，10%也不错，但是可能偶尔还会需要输血。此外，被编辑的细胞有没有生存优势也是影响在体编辑治疗效果的一大因素。在临床治疗中，我们应当首先针对那些只需要1%基因编辑效率就可以产生明显的治疗效果的疾病开展临床研究，然后随着技术的不断进步和临床治疗经验的积累，未来可以拓展到其他疾病中。
张健萍老师：我们目前开展的针对血友病的在体编辑，1%的在体编辑效率就可以获得100%的凝血因子8的表达，所以针对血友病我们不需要太高的在体编辑效率就可以走向临床应用。不同疾病可能对于基因编辑效率的需要并不统一。
Q
目前关于基因编辑的研究中，递送载体也是关键一环，您觉得未来哪种载体的应用会更加有优势？
A
张孝兵老师：载体的选择仍然取决于不同的应用场景。目前AAV载体以其独特的性能占据了主导地位。目前世界上主流的基因治疗公司都选择的是AAV载体。但是也不可否认它的一些缺点，比如基因编辑元件的长期表达会增加脱靶率，以及产生针对Cas蛋白的免疫反应等。在一些应用场景中， AAV载体还很难被替代，比如大脑的基因编辑等。目前比较火的研究方向是利用脂质纳米颗粒LNP来递送编辑组件，但在短时间内还无法替代AAV载体。
Q
目前基因编辑在治疗眼部疾病已经有小范围临床应用，那其距离更大范围的临床应用，还有哪些困难需要解决？
A
张孝兵老师：最主要就是要提高编辑效率，如果效率太低，则很难取得良好的治疗效果。其次就是要考虑免疫反应，因为眼睛是一个免疫豁免器官，另外可以进行局部载体注射，所以开展眼睛基因编辑治疗相对容易。肝脏基因编辑也相当容易一些，而编辑其他器官难度高一些，需要开发更加高效的递送载体。
Q
目前基因编辑工具的开发始终处于研究前沿，您觉得未来基因编辑工具的开发方向是什么？现在来看哪种基因编辑工具更加有发展潜力？
A
张孝兵老师：目前主流的CRISPR-Cas9仍然是最具有优势的，其他的替代品则效果稍差，但是其存在专利权的问题。碱基编辑器只能编辑单个碱基，应用范围有限，但在特定的场景尤其独特的优势。。而介于两者之间的引导编辑器，我觉得未来具有很大的应用前景，因为它不仅可以插入删除小片段，其还可以结合大丝氨酸重组酶可以实现大片段插入。不管采用哪种基因编辑工具，在体的递送效率和编辑效率问题都是其不可回避的问题，只有解决这几个问题，才能在未来的发展中脱颖而出。
Q
目前如果我们想要更进一步提高基因编辑效率，从哪几个方面是我们可以重点去努力的方向？
A
张孝兵老师：我觉得有以下几个方向可以去努力：一是保证高效的递送效率，只有成功将基因编辑元件递送进入细胞，它们才能发挥作用。二是保证Cas蛋白的表达量和HDR模板的拷贝数，如果太低的话，编辑效率会降低。三是提高递送工具对靶器官的靶向性，减少对非靶器官的编辑。
Q
如果要应用基因编辑来解决临床问题，您觉得哪些疾病可能是最适合这种治疗方案？
A
张孝兵老师：对于临床疾病的选择，我觉得首先要考虑安全性，在临床上如果目前没有其他较好的治疗方案，则可以尝试使用基因治疗。其次针对一些高死亡率的遗传病，可以选择基因治疗。最后，要提高大众对于基因治疗的接受度，消除公众对于基因治疗的误解。
感谢两位老师的精彩互动问答，让我们对血细胞重编程和iPSC基因编辑有了更全面的认识。
互动福利
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