Emerg Microbes Infect.|猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导的细胞凋亡依赖于半胱天冬酶和亲环蛋白D

2023-04-06 02:04

细胞凋亡是一种严格调控的细胞死亡机制，由各种细胞外（外在）或细胞内（内在）刺激触发，并由抗细胞凋亡和促细胞凋亡因子调节。细胞凋亡的核心参与者是半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶家族，称为半胱天冬酶，其通过在含有氨基酸天冬氨酸的特定位点切割底物来催化死亡途径中的关键步骤。核缩合是DNA片段化的结果，表现为特征性的寡核小体大小的DNA分子量标准。细胞凋亡也代表了宿主细胞重要的抗病毒防御机制，病毒已经进化出各种复杂的策略来操纵宿主细胞，例如限制宿主的抗病毒反应，这可能有利于病毒复制和持续感染。

猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种最近发现的冠状病毒，可导致不到6天的仔猪出现严重急性腹泻和快速体重减轻。SADS-CoV感染的一个标志是合胞细胞的形成，合胞细胞迅速从病毒感染的细胞传播到周围细胞。合胞体随后被破坏，细胞聚集并从基质分离，伴随着病毒粒子的释放。

迄今为止，SADS-CoV是否会引发凋亡细胞死亡，病毒诱导的细胞凋亡是否影响病毒复制和致病性仍不清楚。因此，本研究旨在探讨SADS-CoV感染的体外和体内效应及其分子机制，以提高我们对SADS-CoV诱导细胞凋亡与其致病机制相关性的认识。

作者首先从超微结构、光学显微镜观察到以空泡化和合胞体形为特征的典型CPE。经过DNA片段化检测以及FACS流式细胞术，发现凝胶电泳梯形带的强度随着感染剂量的增加而增加并且与对照组相比，SADS-CoV感染在24 hpi时产生显着水平的细胞凋亡。综上所述，以上数据表明SADS-CoV感染在体外诱导细胞凋亡。

蛋白质印迹分析显示，裂解的PARP随着感染剂量的增加而增加。在SADS-CoV感染的回肠组织中通过蛋白质印迹验证活化的效应半胱天冬酶-3和裂解的PARP及其活化形式也显示出时间依赖性增加，综上所述，外在和内在途径都有助于SADS-CoV诱导的体外和体内细胞凋亡中的半胱天冬酶-3活化。

为了阐明凋亡细胞死亡的机制和类型，使用广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK进行了实验，该抑制剂可阻断SADS-CoV诱导的细胞凋亡。FACS流式细胞术结果显示，Z-VAD-FMK处理可显着降低VARO E6细胞中SADS-CoV诱导的细胞凋亡，表明半胱天冬酶与SADS-CoV触发的细胞凋亡有关。

接下来，作者研究了相同的半胱天冬酶抑制剂是否会影响SADS-CoV复制。发现泛半胱天冬酶抑制剂以剂量依赖性方式显着减弱SADS-CoV N蛋白表达，显着降低了SADS-CoV诱导的PARP切割。综上所述，数据显示，半胱天冬酶级联被SADS-CoV激活，这表明该过程需要半胱天冬酶活性。

为了鉴定SADS-CoV诱导的细胞凋亡途径，使用了半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的特异性抑制剂。发现半胱天冬酶-8和-9抑制剂以剂量依赖性方式抑制病毒后代的释放，并显着降低了SADS-CoV诱导的PARP切割，结果表明，在Vero E6和IPI-2I细胞中，SADS-CoV可能通过半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9依赖性途径诱导细胞凋亡。这些发现表明，死亡受体介导的外在途径和线粒体介导的内在途径都被激活，并且两种途径之间存在显着的串扰，这可能意味着tBid在SADS-CoV诱导的细胞凋亡中将信号从外源性（半胱天冬酶-8）传递到内在途径（半胱天冬酶-9）。

半胱天冬酶-8在Fas/FasL介导的细胞凋亡中起关键作用。这促使作者进一步测试Fas和FasL是否参与SADS-CoV诱导的细胞凋亡。通过IFA和蛋白质印迹发现FasL表达在SADS-CoV感染的细胞中上调。接下来通过检测SADS-CoV感染时被切割，研究了外在依赖性和内在依赖性细胞凋亡途径之间是否存在串扰。结果表明来自FasL的细胞凋亡信号被传递以激活半胱天冬酶-8，进而切割Bid。Cleaved Bid激活半胱天冬酶-9，它连接外在和内在途径。

接下来又发现，SADS-CoV 感染促进 Vero E6 细胞中的 Bax 和 Cyt c 重新定位，但不会促进 AIF易位到细胞核。

在 SADS-CoV 感染后，Bax 介导的 MOMP 将线粒体 Cyt c 易位到细胞质中，MPTP被认为是最可行的线粒体通道模型。亲环蛋白D（CypD）位于线粒体膜基质中，是MPTP开放过程中的主要成分。CsA处理后，通过FACS流式细胞术发现CsA治疗显着降低了SADS-CoV诱导的凋亡细胞的百分比；完全消除了细胞内DNA片段化；IFA验证发现CsA通过显着降低N蛋白表达对SADS-CoV增殖具有很强的抑制作用；蛋白质印迹分析显示CsA处理显着阻止了病毒N蛋白的细胞内表达。综上所述，CsA熟练抑制了SADS-CoV复制并抑制了SADS-CoV诱导的细胞凋亡。

总之，本研究为SADS-CoV诱导的细胞凋亡在感染过程中的分子机制提供了见解。结果表明：（1）SADS-CoV感染引起细胞凋亡的特征性形态和生化变化，如DNA片段化、染色质缩合、磷脂酰丝氨酸外化、半胱天冬酶活化和体外和体内PARP切割;（2）SADS-CoV诱导的细胞凋亡伴随着半胱天冬酶级联反应的激活，并促进病毒生命周期内体外的有效病毒复制;（3）死亡受体介导的外在途径和线粒体介导的内在途径都在SADS-CoV感染的细胞中被激活;（4）Bax的线粒体易位和伴随的Cyt c的胞质释放强烈表明Bax介导的MOMP诱导SADS-CoV感染后的内在细胞死亡;（5）SADS-CoV的生命周期依赖于CypD。基于我们的发现，提出了SADS-CoV诱导的细胞凋亡机制的示意图模型。