太实用了！全文干货！12图4表，2.64分干湿结合SCI全文复现

大家好，我是奇奇~~今天带来的这篇文章“Bioinformatics Analysis and Identification of Potential Genes Associated with Pathogenesis and Prognosis of Gastric Cancer”是2022年3月发表在Current Medical Science期刊的生信文章，我们一起来看一下吧。

套路： 肿瘤（干湿结合）

数据来源：GSE29272、GSE29998、GSE54129和GSE118916

技术路线：通过GEO数据库下载GSE29272、GSE29998、GSE54129和GSE118916数据集→通过GEO2R分析分别找出四组数据集中上调和下调的基因→通过韦恩图形式筛选出四个数据集中上调和下调基因的交集→通过STRING数据库对差异基因进行PPI网络分析，得到hub基因→对hub基因进行GOKEGG分析和表达差异分析→通过HPA数据库分析hub基因的蛋白表达→通过cBioPortal数据库对hub基因进行→分别对hub基因做KM生存曲线→对hub基因进行免疫浸润分析

Fig. 1 | 四组GEO数据集中的差异表达基因(DEGs)

Fig. 2 | 胃癌中的交集基因的GOKEGG富集分析

Fig. 3 | 差异基因的PPI网络

Fig. 4 | hub基因的GOKEGG富集分析

Fig. 5 | 正常组织和肿瘤组织中hub基因的表达差异分析

Fig. 6 | hub基因在肿瘤组织与正常组织的表达差异

Fig. 7 | HPA数据库中hub基因的蛋白表达

Fig. 8 | TCGA中hub基因的阶段特异性表达和遗传改变

Fig. 9 | hub基因的KM生存曲线

Fig. 10 | hub基因的免疫浸润热图

Fig. 11 | COL5A2在癌旁和肿瘤组织中的免疫组化染色图像

Fig. 12 | COL5A2在体外促进胃癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡的作用

Table 1 | 四组GEO数据集中上调和下调基因的共同交集的基因

Table 2 | 上调和下调DEGs的前15个GO富集条目

Table 3 | 上调和下调DEGs的前5个KEGG富集条目

Table 4 | PPI网络的top 10 hub基因

GEO2R分析

GOKEGG富集情况

制作PPI网络图

IHC病理切片

基因的突变情况和突变影响KM生存曲线

免疫浸润相关性分析

Fig. 1 | 四组GEO数据集中的差异表达基因(DEGs)

Fig. 1A 四组GEO数据集差异基因表达的火山图

Fig. 1B-C 四组GEO数据集上调和下调基因的韦恩图

Fig. 1A复现（第1、3、4个数据集已被仙桃收录，第2个数据集需要在GEO数据库中分析，这里以第1个数据集为例，在仙桃数据集检索中进行复现）

登录仙桃网站（https://www.xiantaozi.com/），选择【数据集检索】，输入数据集名称GSE29272，然后点击检索。

点击【选择样本】，将样本全部选中，点击【添加到样本库】，然后点击【进入我的样本库】。

选中所有的正常样本，点击【加入参考组】；选择所有的肿瘤样本，点击【加入实验组】。

点击【提交分析】。

在分析记录中找到相应的分析结果，点击【下载】-【下载整份报告】。

在报告文件夹中，\xt-reports\output\gds_diff_volcano_plot_gds_main路径下的.png为火山图。

注意在下次分析之前将样本库清空。接下来复现第2张图（仙桃中未收录的GEO数据集）

在GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）网站中搜索数据集名称GSE29998。

在数据集界面中点击【Analyze with GEO2R】，使用GEO2R进行分析。

在【Define groups】中输入“test”然后回车。

选择所有的疾病组（Tumor）（选择之后的数据会变黄），然后点击test，将这些数据归为实验组。

用同样的方法，创建ref组，将所有的正常组（Normal）归入对照组。

下方的【Option】选项卡中，Force normalisation选择Yes，Log 2 fold change threshold中输入1，勾选下方的test vs ref，然后点击【Reanalyze】。

待结果出来之后，点击第一个火山图，点击【Explore and download】可以选择截图，然后点击【Download full table】下载分析结果。

使用仙桃重新绘制火山图。打开该数据集的分析结果（注意保留原始数据存档），只留下Gene symbol、LogFC和padj三列（注意修改pvalue的列头名称），另存为excel文件【GSE29998表达差异】。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【火山图】。

上传【GSE29998表达差异】文件，点击【验证】，然后【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 1B-C复现

打开第1个数据集GSE29272表达差异表（\xt-reports-GSE29272\output中的差异分析.xlsx文件），选择筛选。

在padj列下拉菜单中选择【数字筛选】-【小于】，输入0.05，点击【确定】。再用同样的方法筛选LogFC大于或等于1的数据。

新建一个excel文件，命名为【Venn-up】，将筛选出的基因的Gene Symbol复制到【Venn-up】中，列头为GSE29272。

以同样的方法筛选GSE29272中padj<0.05，LogFC≤-1的下调基因，并复制到另一个【Venn-down】的excel文件中的GSE29272列头下。再分别以同样的方法筛选GSE29998、GSE54129和GSE118916中padj<0.05，LogFC≥1或LogFC≤-1的上/下调基因，并复制到【Venn-up】或【Venn-down】文件中的GGSE29998、GSE54129和GSE118916列头下，并保存文件。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【基础绘图】中选择我们需要用到的【韦恩图】。

分别上传【Venn-up】和【Venn-down】文件，点击【验证】，然后【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

点击下载【交集情况】，分别重命名为【交集情况up】和【交集情况down】。

Table 1 | 四组GEO数据集中上调和下调基因的共同交集的基因

分别打开【交集情况up】和【交集情况down】文件，其中的GSE29272 AND GSE29998 AND GSE54129 AND GSE118916列即为四个数据集中上调/下调基因的交集。

Table 2 | 上调和下调DEGs的前15个GO富集条目

Table 2复现

打开DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov/），点击【Functional Annotation】。

输入基因列表，或直接上传gene list文件，选择id类型【OFFICIAL_GENE_SYMBOL】，选择物种为人类，选择【Gene List】，然后点击【Submit List】。

点击展开GO，点击【GOTERM_BP_DIRECT】的Chart。

新建一个excel文件并命名为【GO_term】，复制前5组数据到该文件中。

只保留Category、Term、Count、%和P-value五列

以同样的方法找到CC和MF的前五个富集条目。

再以同样的方法找到下调基因的前15个富集条目，并在第一列前加一列表示上调或下调。

Table 3 | 上调和下调DEGs的前5个KEGG富集条目

Table 3复现

在【List】中可以看到之前上传过的数据，选择数据和物种，再点击【Use】。

点击展开Pathway，点击【KEGG_PATHWAY】的Chart。

新建一个excel文件并命名为【KEGG_term】，复制前5组数据到该文件中。使用同样的方法复制下调基因的前5个KEGG的term，添加一列Pathway ID和Genes。富集的基因可以点击Genes列的柱状图查看。

Fig. 2 | 胃癌中的交集基因的GOKEGG富集分析

Fig. 2A-C 交集基因的GO富集分析

Fig. 2D 交集基因的KEGG富集分析

Fig. 2A-C复现

新建一个excel文件并命名为【GOKEGG】，列头为id，将上调和下调的基因全部复制到该列头下。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]分析】。

上传【GOKEGG】文件，点击【验证】，下方的富集参数选择全部GO，然后点击【确认】。

点击【保存结果】，对分析结果命名后点击【保存】。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]柱状图】。

默认上传最近一次的分析结果，【主要参数】中的y轴映射改为包含ID的数量，颜色映射改为校正后p值，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 2D复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]分析】。

上传【GOKEGG】文件，点击【验证】，下方的富集参数选择KEGG，然后点击【确认】。

点击【保存结果】，对分析结果命名后点击【保存】。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]气泡图】。

默认上传最近一次的分析结果，ID列表中修改为想要研究的KEGG的ID，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 3 | 差异基因的PPI网络

Fig. 3A 差异基因的PPI网络

Fig. 3B top 19 hub基因

Fig. 3A复现

在STRING数据库（https://cn.string-db.org/）网站中选择Multiple proteins，输入所有的差异基因，物种选择人类，然后点击【SEARCH】。

点击【CONTINUE】。

点击【Exports】，下载第四个.tsv格式的数据。

打开Cytoscape软件，选择Network file to load，上传刚才下载的数据，点击【OK】。

选择【Layout】-【Attribute Circle Layout】-【(none)】。

点击左侧的【Style】可以选择更改样式。

点击Fill Color的第二个框框，选择【Layout】-【Degree Sorted Circle Layout】。

Column选择degree layout，Mapping Type选择Continuous Mapping。

双击渐变图，为渐变修改颜色，然后点击【OK】。

可以用鼠标拖动右侧的节点，以达到更好的可视化效果。

调整好样式之后选择【Export as Image】保存为.pdf或其他格式。

Fig. 3B复现

点击【Apps】-【MCODE】，然后点击左边的加号【+】。

设置degree threshold≥2、node score threshold≥0.2、K-core≥2、max depth=100，然后点击【Analyze Current Network】。

点击第一个，再点击【Create Cluster Network】。

点击【Circular Layout】，调整好样式之后选择【Export as Image】保存为.pdf或其他格式。

Table 4 | PPI网络的top 10 hub基因

Table 4复现

用excel打开之前保存过的.tsv文件（注意保存原始数据）。

删除除第一列、第二列之外的所有列，再删除第一行，再将第二列剪切到第一列末尾。

在B1单元格中输入COUNTIF函数“=COUNTIF(A:A,A1)”（在第A列中计A1基因出现的次数），然后将单元格下拖。

选择复制第二列，在第三列仅粘贴值，再删除第二列。

选中第一列，点击【数据】-【删除重复项】-【删除重复项】。

只选中列A，然后点击【确定】。

以第二列降序排序。

只取前10行，加上列头，加上rank。

Fig. 4 | hub基因的GOKEGG联合LogFC富集分析

Fig. 4A hub基因的GOKEGG联合LogFC富集分析圈图

Fig. 4B 由ClueGO+CluePedia构建的的KEGG分析

Fig. 4A复现

新建一个excel文件并命名为【GOKEGG-LogFC】，输入列头为id和LogFC，id列为top 19基因，并将GSE29272数据集中对应基因的LogFC粘贴至表格中并保存。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG联合FC]分析】。

上传【GOKEGG-LogFC】文件，点击【验证】并点击【确定】。

点击【保存结果】，命名后点击【保存】。

在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG联合FC]圈图】。

默认上传前一次的GOKEGG联合LogFC分析的数据，在【主要参数】中的ID列表中输入GO的ID，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 4B复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GOKEGG]网络图】。

默认上传前一次的数据（KEGG），【主要参数】中选择标注全部，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 5 | 正常组织和肿瘤组织中hub基因的表达差异分析

由于原文使用的Oncomine数据库已停止服务，所以暂时不复现Fig. 5。

Fig. 6 | hub基因在肿瘤组织与正常组织的表达差异

Fig. 6复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【[云]疾病vs非疾病】。

云端数据选择TCGA的胃癌的FPKM格式数据，特殊参数中输入并选择所有的hub基因。

【主要参数】中选择展示点，将颜色改变黑色，大小改为0.1，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 7 | HPA数据库中hub基因的蛋白表达

Fig. 7复现

打开HPA网站（https://www.proteinatlas.org/），在搜索栏中输入hub基因，这里以第一张图中的FN1为例，并点击【Search】。

点击第一个搜索结果，在弹出来的FN1基因数据中点击【TISSUE】。

点击【Gastrointestinal tract】下的【Stomach】。

点击切片图片并下载或截图。

Fig. 8 | TCGA中hub基因的阶段特异性表达和遗传改变

Fig. 8A | hub基因在不同发病阶段的表达情况

Fig. 8B | hub基因的突变情况

Fig. 8C | hub基因突变和未突变组的KM生存曲线（OS）

Fig. 8D | hub基因突变和未突变组的KM生存曲线（DFS）

Fig. 8A复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[云]临床意义（分组）】。

云端数据选择TCGA的胃癌的FPKM格式数据，特殊参数中，以第一张图中的FN1为例，输入hub基因，临床变量选择Pathologic_stage，分组分别为四个Stage。

【主要参数】中选择不展示箱，展示小提琴，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 8B复现

打开cBioPortal网站（https://www.cbioportal.org/），点击左侧的【Esophagus/Stomach】，选择一个TCGA的数据集，再点击下方的【Query By Gene】。

输入10个hub基因，然后点击【Submit Query】。

取消选择【Show whitespace between columns】，点击Download，下载成合适的格式。

Fig. 8C-D复现（接Fig. 8B）

点击上方【Comparison/Survival】，点击【Survival】。

左侧的Overall即为OS曲线，Disease Free即为DFS曲线。

右侧点击下载图片。

Fig. 9 | hub基因的KM生存曲线

Fig. 9A复现

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【临床意义】中选择我们需要用到的【[云]生存曲线（KM图）】。

云端数据选择TCGA的胃癌的FPKM格式数据，特殊参数中，以第一张图中的FN1为例，输入hub基因。

【主要参数】中，时间单位选择月，点击展示风险表格，点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 10 | hub基因的免疫浸润热图

Fig. 10复现

新建一个excel文件并命名为【hub基因免疫浸润热图】，第一列为hub基因，第一行为不同的免疫细胞。

打开TIMER网站（http://timer.cistrome.org/），点击【Immune Association】。

选择基因和免疫细胞，这里以FN1和B cell为例，点击【Submit】。

点击STAD行的TIMER列数据，将Purity和B cell的数据记录在【hub基因免疫浸润热图】表中相应位置。

修改免疫细胞和hub基因，将所有的数据填到表格中，然后保存文件。

进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【交互网络】中选择我们需要用到的【相关性热图[相关矩阵]】。

上传文件，点击【验证】，然后点击【确认】。

出图后可以根据需要保存相应格式的文件（如pdf、tiff等），也可以直接右键图片选择另存为至需要的路径，或者直接复制，再粘贴到相应的地方。

Fig. 11 | COL5A2在癌旁和肿瘤组织中的免疫组化染色图像

Fig. 12 | COL5A2在体外促进胃癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡的作用

Fig. 11和Fig. 12为作者自己的实验部分。