【进展中的科学】深入看清生物组织

Pitruzzello, G. Seeing into deep tissue. Nat. Photon. 17, 376–377 (2023). https://doi.org/10.1038/s41566-023-01200-5

《自然光学》（Nature Photonics）期刊与斯坦福大学的戴宏杰（Hongjie Dai）谈论近红外二区的生物成像及其临床应用潜力。

为什么深层组织成像很重要，NIR-II有什么用？

我们期待能够深入了解生命系统，以高空间分辨率和分子识别的方式收集有关生物结构和过程的信息。如果能以高时间分辨率来实时观察细胞行为和反应，那就更棒了！具备这种能力，我们从极限长度和时间了解生命、疾病和死亡、对设计有效的治疗或手术干预措施都非常重要。

X射线、磁共振和正电子成像技术具有出色的穿透深度，但它们的空间分辨率有限。荧光成像可以实现单分子分辨率和超快的成像速度，但由于组织和自发荧光的散射，体内成像仅限于表层。2009年，我们在第二近红外（NIR-II）或短波红外窗口（1000-1700nm）实现体内荧光成像。我们用的光致发光发射器是单壁碳纳米管，这极大地抑制了生物组织的光散射，允许在毫米深度的小鼠组织中对血管进行成像。比起之前在900nm左右的荧光成像实现深度约100微米，改进显著。世界各地许多团队目前正在利用 NIR-II成像开展各类的小鼠模型临床前研究，以研究淋巴系统、心血管疾病（如外周缺血、中风、创伤性脑损伤和癌症免疫治疗）。NIR-II成像的临床转化也正在兴起。

典型的NIR-II荧光成像是怎么开展的？

NIR-II荧光成像有多种方式，可用于活体动物体内或离体组织样本的非侵入性成像。 

一种方式是宽场成像（widefield imaging）。700–1000nm激光束或 LED光经过扩束，激发动物体内的NIR-II发射源，再用二维的铟镓砷相机检测1000–1700nm光发射。空间分布NIR-II发射源的图像被投影到一个平面上。 

另一种方式是用NIR-II共焦显微镜实现体三维成像（volumetric 3D imaging）。使用聚焦800–1600nm激光束空间扫描，在1000–2000nm范围内逐点（或逐行）检测发射，检测用光电倍增管、铟镓砷探测器线性阵列或超导纳米线单光子探测器。用于体三维成像的光片显微镜 (LSM) 还可以在800–1300nm范围内对薄光片进行z扫描，并使用二维的铟镓砷相机在1000–1700nm范围内逐平面成像。倾斜和结构光照显微镜（LSM-SIM）模式的LSM也已开发出来。

目前能做到哪些？

小鼠体内NIR-II荧光成像可以达到毫米深度，空间分辨率约为几微米，分辨率较低时可达一厘米深度。在时间分辨率方面，可以实现实时NIR-II 成像（每秒 30 帧以上）来收集体内的动态事件。举例来说，我们可以通过完整的头骨和头皮以微米级分辨率对小鼠脑血管系统进行成像，或者可以对大脑和心血管疾病小鼠模型中的血流进行实时血流动力学测量。

在分子成像方面，可以在细胞水平上进行活体组织分子成像。这是通过对与肿瘤或免疫细胞上的细胞表面标记物特异性的抗体或其他靶向配体结合的 NIR-II 发射探针进行成像来完成的。例如，体三维LSM-SIM成像可以识别肿瘤微环境中响应癌症免疫治疗的某些淋巴细胞。使用在1000-1700nm范围内不同波长发射的探针或表现出不同激发态寿命的探针，也可以实现体内多种生物标志物的多重NIR-II分子成像。在NIR-IIc窗口（1700–2000nm）中，也可以使用1650nm激发对小鼠淋巴结进行成像，无需任何手术。在同一窗口中，共焦荧光成像还可以通过完整的小鼠头达到毫米成像深度，并实现非侵入性细胞分辨率成像。

与其他形式的深层组织成像相比，NIR-II荧光有哪些优势？

X射线成像、磁共振成像和正电子发射断层扫描等传统成像方式具有优越的穿透深度，但空间和时间分辨率不如荧光。双光子和三光子成像是具有高空间分辨率的深层组织光学成像的成熟技术可。我们可以进行比较。采用1650nm激发的单光子NIR-IIc成像现在与多光子显微镜中使用的最长激发波长相当，因此表明这两种技术的激发光穿透深度相似。

然而，NIR-IIc单光子激发显微镜中的荧光发射与激发光强度成线性比例，而多光子荧光是非线性的，因此多光子荧光随深度衰减得更快。因此，穿皮NIR-IIc成像可以通过单光子显微镜无创地完成，而多光子成像总是需要手术切除皮肤/头骨。此外，使用单光子NIR-II成像设备比多光子显微镜更便宜。

另一方面，值得注意的是，多光子成像的一个主要优点，是可以利用基因编码的荧光蛋白发射可见光和远红光。相反，在NIR-II窗口中发射的荧光蛋白难以捉摸。一个有前途的方向可能是将NIR-II单光子显微镜与多光子显微镜相结合，两者均采用约1650–1700 nm 激发以最大限度地提高组织穿透力，同时还使用更广泛的荧光探针在成像通道上进行复用。

NIR-II成像对于疾病的早期检测和诊断是否有价值？

由于光谱范围内的生物样品和试剂具有高信号背景比和低干扰自发荧光，NIR-II检测可用于体外诊断。与NIR-II发射集成的即时诊断设备已经推出，并已获得用于检测癌症、心血管和炎症/感染标记物的监管部门批准。使用与抗体或其他靶向配体缀合的NIR-II发射探针进行的临床前体内分子成像已检测到黑色素瘤等浅表肿瘤以及头颈癌中的癌症生物标志物。肿瘤中PD-L1（一种跨膜蛋白）表达的临床前NIR-II分子成像，肿瘤与正常组织信号比能做到较高，显示出它在癌症免疫治疗的诊断和预后方面的潜力。

你如何看待 NIR-II 成像融入临床实践？

多年来，FDA批准的吲哚菁绿染料促进了900nm左右光谱区域近红外成像的临床应用。我相信，新一代临床NIR成像将会出现，通过使用NIR-II探头来增加信号：背景比并提高穿透深度，以评估血液灌注和血管再生以及淋巴系统成像。

此外，在NIR-II中可以实现肿瘤的靶向分子成像，肿瘤边缘清晰可见，从而实现成像引导的高精度肿瘤切除。这些和其他术中NIR-II 像技术预计将在未来的临床实践中发挥重要作用。我相信有望用于临床转化的NIR-II发射器将包括生物相容性有机小分子、生物相容性配体涂覆的金分子簇以及具有稳定、交联亲水涂层的稀土纳米颗粒。

哪些有希望的新发展，让你感到兴奋？

我特别兴奋于最近开发的采用1650 nm激发和NIR-IIc检测的单光子活体三维体共焦成像，因为它突破了激发和发射前沿成像深度的极限。我期望通过在单细胞水平上实时成像和监测淋巴结中的免疫运输和活动，可以做很多事情并学到很多东西。我很高兴利用NIR-II 探针作为双功能疫苗载体和成像探针，旨在观察疫苗贩运并开发新一代有效的癌症和传染病疫苗。迄今为止，已经取得了可喜的成果。

就未来的进展而言，大家感兴趣的另一个领域是将单光子成像推向2200 nm左右的NIR-IId范围，达到NIR 成像窗口的末端，超过该窗口吸水率会减少穿透深度。我还对NIR-II窗口中的生物发光、基因工程荧光蛋白和神经元动作电位传感器的进展非常感兴趣，这些传感器与分子成像探针相结合，将进一步改变体内成像的范式，并大大提高分辨率和功能 。

NIR-II 成像目前有哪些限制，如何解决这些限制？

目前的限制包括：NIR-II荧光或发光体相对稀缺。尽管自2009年以来，碳纳米管、量子点、小分子、稀土下转换纳米晶体和金分子簇，取得了重大进展，但仍有许多工作要做。NIR-II中缺乏基因工程荧光探针，也限制了该领域的发展。所幸越来越多的科学家正在联手应对这些挑战，包括来自不同学科、具有广泛专业知识的化学家、材料科学家、生物化学家、生物学家和医学研究人员。

你怎么看10年后的这个领域？

我设想，10 年内会开发出更宽的NIR-II发射源，包括在1000-2200nm范围内达到10 种颜色用于体内多重分子成像，还有对神经元活动敏感的荧光蛋白和明亮探针。NIR-II成像将广泛用于临床前研究，以深入了解生命系统并实时可视化分子特异性细胞特征。我希望NIR-II成像也能进入临床实践，用于术中应用，例如指导肿瘤切除、绘制淋巴结以评估癌症复分解，以及促进免疫治疗的诊断和预后。