ECOTOX ENVIRON SAFE | 刘楠教授团队采用秀丽隐杆线虫模型揭示环境重金属镉诱导的生殖毒性与卵发生过程

镉(Cd)是一种无所不在的非必需重金属，存在于采矿、冶炼、废水灌溉、废气排放等环境中；它通过多种途径进入人体，包括食物链积累、吸烟等环境暴露和皮肤接触。由于镉的生物半衰期长达10-33年，可与白蛋白结合，吸收后可通过血液循环分布于全身，对人体构成重大威胁，可对肾脏、肝脏和骨骼等多个器官和系统造成急性和慢性损伤。因此，解决镉毒性的方法是一个迫切关注的人类健康问题。大量流行病学研究表明，Cd还可对生殖系统造成各种类型的损害，如卵泡闭锁和卵母细胞成熟延迟。这些研究表明，女性血液中Cd浓度每增加一个标准差，生育能力就会下降22% (Peana et al.， 2021)。低剂量的Cd暴露已被发现在体内通过干扰雄激素、雌激素和黄体酮的生物合成来破坏类固醇生成，导致性别分化紊乱和配子改变。在一项关于女性抗苗勒管激素(AMH)的研究中，环境镉暴露改变了绝经前妇女的AMH水平，并与该组卵巢功能下降有关。

生物监测系统的不断发展为我们评估环境重金属Cd对人类和野生动物健康的影响提供了多种选择。事实上，以哺乳动物为基础的致死率分析对于评估其中许多元素、物质和化学品的毒理学影响是可靠的。然而，在这类研究中使用哺乳动物受到伦理问题和成本的困扰。因此，研究人员倾向于采用这种解剖结构简单，易于繁殖，发育阶段固定、而且寿命短秀丽隐杆线虫作为模式生物进行毒理学评价，并且风险评估结果与哺乳动物相当。此外，使用这种与人类基因具有高度同源性的模式生物，表现出遗传易感性，对环境应激敏感，从而可以在生物体水平上深入了解重金属的毒理学效应。这种毒性可能是由于Cd与雌激素的相似性及其破坏内分泌系统的能力。然而，Cd在转录组水平上引起生殖毒性的确切分子机制仍然知之甚少。

由深圳大学附属华南医院刘楠教授研究团队近期发表了一篇名为“Cadmium-induced reproductive toxicity combined with a correlation to the oogenesis process and competing endogenous RNA networks based on a Caenorhabditis Elegans model”的研究性论文，该文章发现了环境重金属Cd暴露显著降低线虫的子代数量，延长线虫的生殖期。Cd暴露也减少了有丝分裂和减数分裂的粗期期和末期的细胞数量，从而破坏了卵子发生。结合转录测序和生物信息学分析，共鉴定出3167个DEmRNAs。在基因表达方面，我们发现cul-6、mum-2和ang-1与cd诱导的生殖毒性有关，并构建了它们相互竞争的内源RNA网络。我们观察到Wnt通路中mom-2和ang-1的突变可以诱导Cd引起的减数分裂损伤的易感性。综上所述，Cd对秀丽隐杆线虫的生殖毒性有一定的抑制作用，Wnt通路可能是Cd对线虫生殖毒性的保护机制之一。这些发现有助于更好地了解镉对人体生殖系统的破坏作用及其分子生物学机制。该研究成果于2023年发表在国际著名学术期刊《Ecotoxicology and Environmental Safety》上，中科院一区杂志，河南大学曲直副教授为第一作者、河南大学黄河学者特聘教授与郑善清与刘楠教授为共同通讯作者。主要的发现如下：

1.暴露于环境Cd的野生型线虫的寿命比正常组明显缩短，并呈现剂量依赖效应

当线虫暴露于不同浓度的Cd时，观察到寿命缩短的趋势，从而表明对线虫寿命的剂量依赖效应(图1A)。随着Cd浓度的增加，线虫的中位生存时间从对照组的17天减少到12天、8天和5天。较高浓度的Cd导致线虫的中位存活时间较短；而较低浓度的线虫与正常线虫的存活时间差异不大。最终，我们选择30 μM作为整个研究的最佳浓度。线虫的平均存活时间依次递减，从对照组的15.20±0.70天下降到11.27±0.58天、8.86±0.54天和5.66±0.48天，随Cd暴露浓度的升高而递减(图1B)。以线虫的产卵量、产卵率和产卵时间为指标，评价了镉对线虫育性的影响。与对照组相比，暴露组的产卵量显著减少(P<0.05)，繁殖高峰和繁殖末期均延长(图1C和D)。Cd接触1和2 天后，暴露组的产卵率显著低于对照组。然而，在随后的4和5个暴露期间，它超过了对照组(图1E)，间接表明暴露后生殖周期延长。然而，暴露组和对照组之间的世代时间没有显著差异(图1F)。这些发现表明，长期接触Cd可能对线虫的生育能力产生不利影响。

图1 不同浓度Cd处理下线虫的寿命和生育指数。(A)不同浓度Cd处理下N2虫的存活曲线；每次处理样品计数均大于50；(B)以0、10、30(后续实验的最佳处理浓度)和60 μM Cd处理N2虫的平均寿命；(C) N2虫对Cd的影响；(D)接触Cd每日产卵数；(E) Cd对N2虫的产卵率/h；(F)暴露于Cd的N2虫的世代周期。

2. 镉暴露对野生型线虫的产卵和受精卵状态产生不利影响

在显微镜下检查受精卵，发现Cd暴露后的异常情况，如体内孵化(图2A)。为了进一步了解Cd对排卵和受精卵的影响，我们以子宫内受精卵的数量和状态作为评价标准。与对照组相比，暴露组在第2天受精卵数量显著减少，后期卵百分比显著增加(图2B和C)。而且，暴露于Cd 5天后，实验组的宫内卵数量超过对照组，表明Cd暴露后线虫的产卵期延长(图2B)。这些结果表明，长期暴露于Cd会阻碍野生型线虫受精卵的产生和排泄过程，可能导致观察到的产卵量和产卵率下降。

图2 (A)接触Cd后N2虫受精卵的产生和状态。(A)接触Cd后受精卵的表型异常(a:早期卵可以正常排出；b:后期卵；c:体内孵化的L1幼虫的数量)；(B和C) Cd暴露组和对照组子宫受精卵和晚期卵计数情况。

3. Cd暴露对野生型线虫卵母细胞计数的影响

通过DAPI染色，野生型线虫的卵母细胞呈现蓝色荧光(图3A)。我们的观察显示，暴露于Cd 2天后，暴露组线虫的卵母细胞总数明显低于对照组(图3B)。此外，暴露组同时经历有丝分裂和减数分裂过程的生殖细胞数量也低于对照组(图3C和D)。此外，有丝分裂和减数分裂区域明显分开，未发现异常细胞核(图3A)。

图3 镉暴露对线虫生殖细胞增殖的影响。(A) DAPI染色野生型线虫性腺细胞示意图，白线左侧为有丝分裂细胞，右侧为减数分裂细胞;比例尺代表50µm；(B-D) Cd对生殖系细胞总数、有丝分裂细胞总数和减数分裂细胞总数的影响。

4. Cd暴露对野生型线虫减数分裂的影响

减数分裂的开始以生殖细胞进入过渡区为特征。我们的观察显示，暴露组在过渡区正常出现新月核卵母细胞，与对照组相比，卵母细胞数量无显著差异(图4A)。在减数分裂Ⅰ期阶段，同生过程的中断或染色体的损伤可能导致具有胚胎致死表型的非整倍体线虫数量的增加，并可能导致更高的雄性后代率。有趣的是，我们的研究结果表明，接触Cd后，线虫的后代中几乎没有雄性，雄性比例与正常野生型线虫的后代相似(<0.02%)。在正常情况下，生殖细胞通过过渡区进入性腺环区时处于粗线期。AO染色显示出密集的黄绿色荧光(图4B)。然而，暴露于Cd 2天后，线虫在粗线期的细胞数量明显减少(图4C)。部分粗线素细胞在环区正常发生生理性凋亡。这些凋亡细胞可以通过AO染色确定(图4D)。进一步分析Cd暴露前后粗线细胞的凋亡水平，暴露组的凋亡水平明显高于对照组(图4D)。此外，卵母细胞的数量和2期卵母细胞的横向直径也在发育过程中减少(图4 E和F)，表明Cd暴露可能导致减数分裂成熟异常。

图4 过渡区以外镉暴露对减数分裂细胞的有害影响。(A)镉暴露对过渡区细胞数量的影响；(B) AO染色N2虫凋亡细胞的荧光显微镜照片;箭头表示凋亡细胞。比例尺代表50µm；(C) Cd暴露后线虫生殖系细胞凋亡的变化；(D) Cd暴露对粗线细胞数量的影响；(E和F) Cd暴露对糖尿病2期卵母细胞数量和卵母细胞横径的影响。

5. Cd暴露对全转录组表达的影响

Cd暴露后，共鉴定出3167个DEmRNAs，包括1628个上调表达和1539个下调表达，以及143个DElncRNAs，包括108个上调表达和35个下调表达。此外，根据我们的筛选标准，发现69个DEmicroRNAs，其中39个表达上调，30个表达下调，其中26个DEcircRNAs, 20个表达上调，6个表达下调(图5A-D)。

图5 Cd诱导N2虫的全转录组变化(A-D) mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的火山图；红色(上调)和蓝色(下调)的差异RNA表达；灰色标记无明显表达变化；(E)前10条显著富集的DEmRNAs KEGG通路；(F)暴露于Cd 2 d的N2虫DEcircRNA、DElncRNA和DEmRNA的表达水平。

随后，对DEmRNA进行KEGG通路分析。该分析显示，与细胞色素P450代谢、Wnt信号通路、ABC转运蛋白、TGF-β和Wnt通路相关的通路显著富集(图5E)。由于测序结果可能存在一定的假阳性率，因此采用RT-qPCR验证Cd暴露2天后靶基因表达的准确性。一些circRNAs、lncRNAs和mRNA，如mom-2、ced-3和cull -6的基因表达水平检测结果与转录组测序结果一致(图5F)。虽然在线虫暴露于Cd 2天后，ang-1的表达有所下降，但差异无统计学意义(图5F)。在WormBase和GO数据库中描述的靶基因(表2)进行功能富集分析。该分析揭示了可能与cd诱导的秀丽隐杆线虫生殖损伤相关的特定基因，包括mom-2、ang-1、ced-3和cull -6，它们在不同的途径中富集，如图6所示。在和弦图中，左侧的基因按照log2FC的值降序排列，右侧的通路按照富集分数排序。

图6 DEmRNA and KEGG的关系

3.7. ceRNA网络的构建

为了基于DEmiRNA和qPCR鉴定的验证基因的相互作用获得可能的ceRNA网络，我们采用了三种不同的算法：Targetscan、miRanda和RNAhybird。这些算法预测和识别共享的目标miRNA。我们总共获得了31对与DEmiRNAs相对应的mRNA-miRNA相互作用(图7A)。我们的分析扩展到预测可能的靶lncRNA和受DEmiRNA调控的circRNA，揭示了4对差异表达的miRNA-lncRNA相互作用(图7B)和24对miRNA-circRNA相互作用(图7C)。组成ceRNA网络的特定调控关系如图7D所示。这一分析过程最终构建了一个包含3个mRNA (不含cul-6)、4个miRNA (miR-1824-5p、miR-2221、miR-238-5p和miR-243-5p)、5个cirRNA和26个lncRNA的ceRNA网络。

本研究观察到线虫在Cd暴露后粗成期生殖细胞凋亡扩增，表明细胞凋亡可以作为Cd暴露的敏感指标。线虫的核心凋亡通路与人类具有高度的同源性，ced-3与人类caspase-2、-3和-6相对应。ced-3表达水平升高与细胞凋亡水平升高相关。然而，我们的转录组测序和RT-qPCR结果均证实Cd暴露后ced-3表达水平下降，表明Cd诱导的生殖细胞凋亡可能有其他信号通路介导。在这一生物过程中，我们还发现了cull -6、skr-3、skr-4和skr-5等上调基因的富集。相反，skr-7、skr-8、skr-9等下调基因在TGF-β通路中也显著富集。后三个基因表现出高度的同源性，并与cul1相互作用，cul1对胚胎和幼虫的发育以及细胞增殖至关重要。此外，cul1在细胞周期或凋亡途径中从G1到G0的发育程序转变中起着至关重要的作用。值得注意的是，culk -6是由祖先culr -1的重复产生的，研究发现它通过与skr-3的相互作用增强了线虫的抗逆性。然而，cul1和cul6之间不存在功能冗余。因此，需要进一步的研究来阐明cull -6在线虫生殖系统以及cd诱导的损伤中的作用。这些发现为深入探索基因表达调控和细胞稳态的复杂分子途径提供了有价值的基础。

图7 ceRNA网络的建立。(A-C)预测mRNA-miRNA、miRNA-lncRNA和miRNA-circRNA对及其交叉两种预测工具的结果。(D) mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA的具体网络调控关系。

7. cul-6、mom-2和ang-1在cd诱导性腺有丝分裂损伤中的作用

为了研究cul-6、mom-2和ang-1在Cd暴露诱导的有丝分裂细胞增殖阻滞中的潜在作用，我们用DAPI染色了性腺有丝分裂区域，并对相应的基因突变进行了观察(图8A)。结果显示，与野生型线虫N2相比，cull-6、mom-2和ang-1突变体的有丝分裂细胞数量没有明显变化(图8B)。此外，与Cd暴露后的N2相比，cul-6、mom-2和ang-1突变体有丝分裂细胞的减少程度也没有显著变化(图8B)。这些发现表明，这些基因可能与Cd暴露引起的有丝分裂区细胞增殖的减少无关。

图8 Wnt通路mom-2、ang-1和cul-6介导Cd暴露生殖毒性机制(A) DAPI染色的mom-2、ang-1和cull -6突变体的生殖腺细胞荧光显微镜照片，白线左右为有丝分裂细胞和减数分裂细胞；(B) mom-2、ang-1和cul-6突变的Cd暴露对线虫有丝分裂细胞数量的影响；(C) AO染色mom-2、ang-1和cul-6突变体凋亡细胞的荧光显微镜照片(箭头为凋亡细胞)；(D-E) Cd暴露对mom2、ang-1和cul-6突变线虫的卵母细胞和粗线细胞凋亡的影响。

8. mom-2和ang-1在Cd暴露减数分裂损伤中的作用

对相应基因突变线虫的性腺也进行AO染色，观察凋亡水平的变化，目的是检测cul-6、mom-2、ang-1是否参与Cd诱导的粗线素损伤(图8C)。如图8D所示，Cd暴露2天后，与野生型N2相比，mom-2和ang-1突变体线虫的种系细胞凋亡水平显著增加，表明它们参与了Cd诱导的细胞凋亡的调节。我们还记录了突变线虫在Cd暴露前后的促卵母细胞数量变化。我们发现，暴露于Cd后，mom-2和ang-1突变线虫的指数明显低于N2 (图8E)。而对于cul-6突变线虫，与N2相比，在凋亡和衰竭过程中生殖系细胞数量的变化无统计学差异(图8 D和E)。

经典的Wnt途径(由mom2、egl-20、cwn-1和cwn-2编码)依赖于Wnt配体与卷曲受体的结合来激活β-连环蛋白并将其转运到细胞核中，而非经典的平面细胞极性(PCP)途径通过不涉及β-连环蛋白的不同分子机制发挥作用。然而，最近的研究表明，作为线虫中PCP成分Strabismus/Van Gogh的唯一同源物，ang-1可能在调节生殖功能中发挥关键作用。以往的研究主要集中在ang-1对神经元细胞迁移和突触生长的影响上。然而，另一项研究发现，变异后的ang-1可导致后代数量减少、排卵率降低、生殖期显著延长，这表明生殖腺也可能是ang-1的主要功能部位，ang-1可能参与调节生殖功能。

2. 柚皮苷通过促进自噬，降低脂肪含量来延长线虫的寿命的机制路线图

图9 本研究观察到镉接触生殖毒性的途径及影响机制线路图

在本研究中，我们建立了环境镉污染导致生殖效应的秀丽隐杆线虫模型，线路图如图10所示。我们的研究旨在探讨关键基因在Cd诱导的生殖毒性中的作用。数据显示cull -6、mom-2、ang-1的RT-qPCR结果与全转录组测序结果一致。Wnt和TGF-β通路在Cd诱导的生殖毒性中的作用很少被研究，cul-6、mom-2和ang-1在cd诱导的卵发生损伤中的作用尚不清楚。然而，我们发现每个突变体的有丝分裂区细胞的减少程度与N2相比没有差异，这表明Wnt通路中的mum -2和ang-1以及TGF-β通路中的cul-6可能没有参与调节Cd诱导的生殖细胞增殖功能障碍。相反，mom-2和ang-1可以负向调节Cd诱导的粗期细胞凋亡。Cd也影响减数分裂的成熟。一些研究表明，糖尿病期细胞数量减少可能与粗化期细胞凋亡增加有关。我们的研究结果表明，在Cd暴露后，mom-2和ang-1突变体线虫的终末期细胞数量少于野生型线虫。此外，两种突变体线虫对Cd诱导的细胞凋亡更敏感。这些研究结果表明，Cd暴露影响线虫减数分裂的成熟，可能是由于Wnt信号通路的信号转导减少导致粗线细胞凋亡。有趣的是，我们还通过全转录组分析观察到Cd暴露后表达水平的变化，强调了参与生殖毒性的分子过程的复杂性。总的来说，这项研究揭示了信号通路之间复杂的相互作用及其对生殖健康的影响。

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