PLOS Pathog. | 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染通过内质网应激诱导的钙信号触发自噬促进病毒复制

2023-10-01 00:10

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起猪的一种以繁殖障碍和呼吸道疾病为特征的高度传染性疾病，自出现以来，给全球养猪业造成巨大的经济损失。它最早于1987年在美国发现，随后在各国相继发生，我国大陆于2006年首次暴发高致病性PRRS，能够引起猪全身高热，死亡率高，给我国养猪业造成巨大的经济损失，至今该病仍是影响养猪业健康发展的主要疫病之一。由于没有特效治疗药物和有效的疫苗防治。所以充分了解PRRSV复制的机制有助于控制疾病有效策略的制定。钙离子(Ca2+)是第二信使，参与许多细胞功能。病毒经常劫持Ca2+信号或者扰乱细胞内Ca2+稳态，从而促进病毒的进入、复制、组装和释放等过程。作者发现PRRSV感染引起细胞外Ca2+内流，并通过CaMKII-AMPK-mTOR途径诱导自噬，进而促进病毒的复制。

PRRSV感染导致胞浆内钙离子升高

作者检测了PRRSV感染MARC145细胞期间的细胞内钙水平。作者构建了PRRSV-GFP的感染性克隆。拯救后，感染MARC145细胞，发现胞浆中钙离子的不断增加（图1A和图B）。钙荧光信号的强度也不断增强(图1C)。而未感染病毒的细胞内钙离子水平无明显变化。细胞质中的钙离子水平和钙荧光强度随着病毒MOI的增加而增加(图1D-1F)。

细胞内钙离子有利于PRRSV复制

作者发现PRRSV-N(ORF7)mRNA的表达以及PRRSV-N蛋白的表达随着钙螯合剂（BAPTA-AM）剂量的增加而降低（图2A与图2B），PRRSV的滴度也在降低(图2C)。随钙螯合剂剂量的增加PRRSV感染的细胞胞浆钙水平而降低。钙螯合剂剂量不影响细胞活力(图2E)。表明胞内的Ca+促进病毒的增殖。作者通过观察正常和无钙条件下培养的MARC145细胞中PRRSV复制的情况来进一步明确胞内钙离子在PRRSV复制中的作用。发现在无钙条件下，细胞的PRRSV N基因的水平和PRRSV滴度比正常的细胞低(图2F-2H)。在两种培养液中，感染PRRSV的细胞内钙离子水平比未感染的细胞高。并且，正常培养液中的细胞内钙离子水平显著高于无钙培养液中的细胞内钙离子水平。(图2I)。表明胞内钙离子利于病毒。

细胞内钙离子通过自噬促进PRRSV复制

钙螯合剂处理后，ER自噬被抑制(图3A)。自噬斑块的形成也以钙螯合剂剂量依赖性方式减少（图3B和3C）。在无钙培养液中培养的细胞，LC3II水平和自噬斑块低于正常培养液中的细胞（图3D，3E和3F）。用透射电子显微镜观察钙螯合剂处理和无钙培养条件下病毒感染诱导的自噬小体的形成。钙螯合剂或无钙培养液处理下病毒感染诱导形成的的自噬小体比用 DMSO处理条件下减少。证明病毒诱导的自噬与细胞内钙离子水平之间存在关系。在正常和无钙条件下培养的细ER胞中，通过敲除自噬相关基因（ATG7）来检测病毒感染诱导的自噬过程。ATG7敲除后，LC3II/I的表达减少，表明自噬过程受到抑制。而有钙离子Ca+和Ca+的细胞之间的复制差异不显著(图3H和3I)。这些结果表明细胞内的钙离子通过自噬途径促进PRRSV的复制。

PRRSV通过CaMKII-AMPK-mTOR途径诱导自噬

PRRSV感染可导致CaMKII、磷酸化AMPK和LC3II表达水平增加，而磷酸化mTOR表达下降（图4A）。表明病毒感染激活了CaMKII-AMPK-mTOR通路。为了进一步确定CaMKII-AMPK-mTOR途径在PRRSV复制中的作用，添加CaMKII或AMPK抑制剂，然后监测PRRSV诱导的自噬和复制。为了确定CaMKII对PRRSV复制的影响，设计了CaMKII的小干扰RNA（图4B）。干扰以后，CaMKII表达有利于病毒诱导的自噬和复制（图4D，4E）。KN-93是CaMKII抑制剂，处理细胞，发现PRRSV诱导的自噬减弱（图4F），病毒复制也受到了抑制（图4G）。用AMPK抑制剂处理细胞也观察到了同样的结果（图4I，4J）。用钙螯合剂处理细胞，发现病毒诱导的自噬和复制均减少（图4L）。CaMKII-AMPK-mTOR途径受到抑制。CaMKII、p-AMPK水平降低，p-mTOR水平升高。说明PRRSV感染过程中细胞内Ca+的增加通过CaMKII-AMPK-mTOR途径激活了自噬，并促进PRRSV的复制。

PRRSV感染过程中内质网摄取细胞外的Ca+

为了进一步研究外源Ca+对PRRSV复制的作用，不同浓度Ca+的培养液中，自噬随着Ca+的增加而增加；CaMKII表达水平也增加；p-AMPK升高，负反馈p-mTOR下降（图5A）。病毒滴度也随着Ca+浓度的增加而增加(图5B)。胞浆和内质网钙离子水平都随着外源钙离子的增加而增加，但感染细胞的增幅明显高于未感染细胞(图5C和5D)。表明病毒感染导致细胞外Ca+内流，并通过激活CaMKII-AMPK-mTOR途径促进PRRSV的复制。

PRRSV感染诱导内质网应激和SOCE通道摄取细胞外的钙离子

感染病毒的MARC145细胞中GRP78的表达以及内质网和胞浆Ca+水平升高(图6B和6C)。激活CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号，Orai1和STIM1水平的增加，说明SOCE通道的打开(图6A)。使用mCherry-STIM1和GFP-Orai1评估了病毒感染过程中ER-PM接触部位(CSs)的重塑，发现STIM1和Orai1重新分布在各自的膜内，并呈现“点状”，表明形成ER-PM 和开放的SOCE通道(图6D)。作者检测了内质网应激和SOCE通道抑制剂处理的细胞胞浆和内质网Ca+的水平。4-PBA内质网应激抑制剂处理后， STIM1、Orai1和GRP78的表达降低。此外，CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号转导(图6E)，内质网和胞浆中的C水平降低(图6F和6G)。4-PBA处理显著降低了病毒的复制(图6H)。STIM1的ML-9 HCL抑制剂阻断SOCE通道后，STIM1和Orai1的表达水平下降，内质网应激同样被抑制，GRP78的表达水平下降 (图6J)。表明，Ca+内流与ER应激有关。ML-9 a+HCL还抑制了PRRSV诱导的Ca+内流、CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号的激活和病毒的复制(图6K、6L和6M)。敲除STIM1和Orai1的siRNA，检测CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号通路的激活、PRRSV诱导的钙内流和病毒复制。此外，使用siSTIM1-Mix或单独使用siSTIM1来降低STIM1的表达，抑制了病毒诱导的Ca+内流，也抑制了CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号，降低了病毒复制(图6Q-6T)。说明PRRSV感染诱导ER应激，并通过SOCE通道摄取胞外的Ca+。

内质网相关的钙离子通过IP3R通道而不是RyR通道释放到细胞质内

内质网钙释放通道，包括RyR和IP3R。当IP3R的抑制剂2-APB处理感染和未感染的MARC145细胞时，抑制CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号激活，胞浆和内质网中的Ca+降低(图7A-7C)，病毒复制下降(图7D)。RyR的抑制剂Dan处理不影响PRRSV的复制或相关蛋白的表达，细胞质和内质网中的Ca+水平也不受影响(图7F-7I)。说明ER的Ca+是通过IP3R通道释放到细胞质的。

PRRSV 的Nsp2与STIM1和GRP78相互作用诱导自噬

作者在高表达Nsp2和Nsp5的MARC145中诱导了ER应激(图8A和8B)，在高表达Nsp2的细胞中LC3II和STIM1的表达增加(图8C)。胞浆和内质网中的Ca+浓度随着Nsp2表达的增加而升高 (图8D和8E)，表明Nsp2在PRRSV诱导的Ca+中起主要作用。共聚焦同样显示Nsp2诱导的ER自噬(图8F)。共聚焦发现Nsp2与GRP78和STIM1相互作用，并在ER共定位(图8G和8H)。免疫共沉淀实验中，GRP78和STIM1可被Nsp2拉出 (图8I)。说明，Nsp2在PRRSV感染过程中诱导内质网应激和开放SOCE通道中起主要作用。

PAM是PRRSV的靶细胞，研究PRRSV在PAM中诱导的ER应激发现与MARC145细胞一样，PRRSV感染触发了CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号转导(图9A)，胞浆和内质网Ca+水平增加(图9B和9C)。ML-9 HCL抑制PRRSV诱导的ER应激、CaMKII-AMPK-mTOR-LC3II信号激活、Ca+含量和PRRSV复制(图9D-9G)。

说明ER应激相关的Ca+诱导的自噬利于PRRSV在PAM中的复制。