1+1>2! 这篇7+m6A单细胞代表作模板，直接整高级！

公众号新闻

2022-10-22 09:10

一、研究背景

N6-甲基腺苷（m6A）是RNA甲基化修饰中最常见的形式，是生信研究的热点方向，相关研究也比较容易发到影响因子在3~10分之间的期刊。

m6A mRNA调控在肿瘤发生、肿瘤发展和转移中起着重要作用。新的研究发现肿瘤微环境（TME）在肿瘤的进展和转移中的关键作用。

肿瘤微环境也是单细胞研究的热门。

那么，两个热门联合起来，会不会有1+1>2的结果呢？

各位小伙伴是不是已经在畅想发高分拿毕业证拿职称走上人生巅峰的场面了呢？

m6A介导肿瘤微环境套路

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下面我们看一下影响因子，

首先打开Pubmed，输入(Tumor microenvironment) AND (m6A)，一共348篇文章，有345篇都是最近两年发表的！还是逐年上升！

根据相关性排序，扑面而来就是10+文献

接下来根据发表时间排序，7+代表作很容易，保底也有3+

低至3+兜底，高到10+高分文，应有尽有。

多种类型TME细胞都可以分别分析讨论，研究内容很丰富！

有没有很心动呢？只需公共数据库挖掘就能搞定！

下面我们就根据一篇8+文献举例说明一下文章套路。

Gao Y, Wang H, Chen S, An R, Chu Y, Li G, Wang Y, Xie X, Zhang J. Single-cell N6-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy. J Transl Med. 2022 May 4;20(1):197. （IF=8.440)

二、数据集

GSE132465：选择23名CRC患者的单细胞mRNA序列（scRNA-seq）数据

TCGA和GEO数据库：2653名CRC患者的11个bulk mRNA sequence或芯片数据集

三、套路分析

无论怎样的分析，我们都可以归纳到“挑圈联靠”的套路里。

一、癌症患者TME细胞的聚类与注释，m6A调节因子在不同类型细胞中的差异性表达（挑、圈）

首先是挑，我们的目的就是在不同类型的细胞和mRNA差异表达间建立联系，我们的首要目的就是要建立各种不同。同时做功能富集分析，也就是靠。

我们对研究所用数据集中的细胞，做细胞类型注释的t-SNE图；将细胞分为不同的类型，展示细胞数据特征，以发现不同样本间的异质性（图1B）。

细胞图谱分析(Cell-chat analysis)展示不同细胞类型之间的细胞-细胞通讯(Cell–Cell communications)（图1C）。

根据不同变量（是否肿瘤组织、MSI、年龄、阶段和性别）区分CRC样本，比较不同分组间的m6A调节因子表达差异（图1D）。

不同类型细胞中m6A调节因子差异表达（图1E），以及不同样本中的差异表达（图S1A）。

接下来对scRNA数据中主要的四种类型的TME细胞（CAFs、巨噬细胞、T细胞和B细胞）的23个m6A调节因子RNA表达量分别进行NMF聚类。

评估m6A调节因子与TME细胞的免疫状态之间的关系，我们还使用“estimate” R包对CRC的TME细胞估计ImmuneScore。在六种TME细胞类型中，我们用ImmuneScore发现writer和eraser调节因子有不同的强关联（图S1B）。

这一步主要是对TME细胞进行聚类，再分析m6A的差异表达。

二、m6A调节因子在成纤维细胞特征形成中的作用（挑）

做热图，拟时序分析筛选出在TME细胞的轨迹过程中具有关键作用的m6A调节因子，包括成纤维细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4 + T细胞和CD8 + T细胞等（图2A）

后面我们会根据筛选出的不同类型的细胞分别做相同套路的分析。

首先做细胞通讯分析，找到与m6A相关的成纤维细胞群和上皮细胞之间存在配体-受体联系（图2B），确立细胞-细胞通讯，也可做热图筛选四个NMF聚类簇的Top基因。（图S2E）

得到4个成纤维细胞群后，就可以比较肿瘤组织和正常组织中，不同细胞群所占的比例。（图2C）

接下来就是几个热图

图2D显示在主要的m6A成纤维细胞群中DEGs激活的KEGG途径。

图2E显示不同的m6A相关成纤维细胞群与之前的signature相关性热图。

使用PySCENIC在Python软件中比较平均AUC，来评价转录因子在四个m6A相关成纤维细胞群中的活性的差异。（图2F)

不同m6A相关成纤维细胞群中常见信号通路基因也存在差异表达。(图2G）

最后由REAC数据库对Cytoscape中m6A相关成纤维细胞类型的激活信号途径和功能进行富集分析 （图2H）。

三、m6A介导的巨噬细胞的典型特征（挑）

对巨噬细胞，t-SNE进行聚类降维（图S4A）。然后，我们得到了五个主要的m6A巨噬细胞群，热图显示相关性（图S4B）和差异表达（图S4C）

细胞通讯分析显示主要的m6A相关巨噬细胞与上皮细胞之间的细胞-细胞通讯（图3A)。m6A-巨噬细胞NMF簇的平均数量和细胞比例在正常和肿瘤之间显示出明显的差异（图S4D）。

巨噬细胞的不同基因特征也可以做t-SNE图（图3B）和相关图（图3C）。

免疫检查点分析在五个m6A-巨噬细胞群中表现出明显的不同（图S4G）。使用PySCENIC在Python软件中比较转录因子的平均AUC，巨噬细胞的不同集群中，潜在转录因子的激活情况不同（图3D）。

为了评估m6A-巨噬细胞集群和通路之间的关系，使用GSVA，检测到113条代谢途径中的41条在五个m6A-巨噬细胞群之间有明显的不同（图3E）。

50条标志途径在五个细胞群中显示出广泛不同的活性（图S4H）。REAC数据库对Cytoscape中m6A相关巨噬细胞类型的激活信号途径和功能的富集聚类分析。（附加文件2：图S5B）。（图3F）。

四、m6A介导的T/B细胞表型对CRC的抗肿瘤免疫反应的作用（挑）

对检测到T细胞中，通过t-SNE进行聚类降维（图4A）。使用NMF算法共识别出5个m6A相关的细胞群，并命名为methy-T-C1至methy-T-C5（图4B），细胞通讯分析显示m6A相关的T细胞群与肿瘤上皮细胞之间的配体-受体链接（图4C）。免疫检查点分析也显示这些m6A相关的T细胞群之间的表达明显不同（图S5A）。

网络通讯分析，做热图显示，在这些m6A集群的T细胞中，转录因子的表达有明显的差异（图4D）。热图显示，不同功能的T细胞相关标记的免疫基因的平均表达有许多差异（图4E）。

REAC数据库对Cytoscape中m6A相关细胞类型的激活信号途径和功能的富集聚类分析。（附加文件2：图S5B）。

细胞图谱分析显示主要的m6A相关B细胞类型之间的细胞-细胞交流。接着是通过NMF聚类算法对指定B细胞的m6A簇的数量和百分比的条形图，本图没有显示明显差异图4F、G）。热图显示总的B细胞中m6A簇之间明显不同的转录因子（图4H）。

对m6A相关的各类型TME中的m6A表达情况做完差异分析的功能富集分析后，我们需要对m6A介导的TME模式的临床意义（靠）和细胞间的通讯（联）做总结分析。

临床应用才是我们追求的。

五、m6A介导的TME模式对CRC的预后和免疫治疗的作用（靠）

为了获得主要的CRC TME细胞类型的特征，研究者计算了CRC scRNA数据中的DEG，提取了前30个作为cell marker。然后，根据m6A介导的TME细胞的所有DEG，研究者使用GSVA分析，对8和11CRC队列CRC患者的OS和RFS进行meta-analysis，探讨它们在CRC患者和泛癌中的预后，如图5中所列。

Cox回归分析显示，随着m6A介导细胞亚型中主要的m6A基因的变化，无复发生存率RFS（图5A）和总生存率OS（图5B）出现了显著的不同。

logistic回归分析显示，m6A sub TME cell在预测13个公共癌症队列中接受免疫治疗的患者的免疫反应方面也表现出同样的显著差异（图5C）。

研究者分析了m6A相关细胞亚型在泛癌患者中的预后情况（图S6A和B），发现不同的细胞亚型对不同的癌症有显著的预后作用。