我眼中的NK细胞——田志刚院士讲座(五)
中国工程院院士
欧洲科学院院士(Academia Europaea)
中国科技大学学术委员会副主任
中国科学技术大学免疫学研究所所长
中科院天然免疫与慢性疾病重点实验室主任
田志刚院士与免疫学界的同行们一起，有效地推动了中国免疫学的发展，特别是推动了中国免疫学研究的国际化。
上一篇文章介绍了智能化NK细胞的免疫治疗。
本文继续介绍如何操控NK细胞的智能设计与人工合成。
△图1
NK细胞经过“智能化+定量化+工程化”后，就是新的NK细胞了。
智能化、定量化、工程化的过程，需要依靠对NK细胞的认识——我们对NK细胞的认识程度，将会影响到它的操控程度，这是技术和科学的紧密合作。
△图2
运用同种异体外周血细胞治疗肿瘤病人，这是田志刚院士90年代前后在山东肿瘤生物治疗研究中心时做的一个临床观察。（山东肿瘤生物治疗研究中心成立于1989年5月，是全国最早正式挂牌、有国家编制的机构。）
图2中的研究论文是1994年发表的，那时候就能看出同种异体NK细胞的价值。
患者自体NK细胞只能治疗自己，不能治疗其他患者，产品的研究价值大幅度下降。（例如晚期肿瘤病人，他的细胞即使取出来也不能再生产出能达到治疗标准的NK细胞，所以同种异体NK细胞具有很强的研究价值和使用价值。）
同种异体LAK细胞是NK细胞的前身（即淋巴因子活化杀伤细胞），它的NK细胞含量大概2%~30%，扩增的倍数在100倍以内，这是当时技术能达到的最高水准。
△图3
带着以上问题，田院士利用动物模型做了实验（因为动物模型可控性高，可以尖锐清晰地看出研究假设是否正确，不受其他因素影响，而人群的变异性太大，这也是为什么现在NK细胞比T细胞更受关注的一个根本原因），首次用动物模型证实同种异体NK细胞的使用价值，证实小鼠同种异体NK细胞可治疗肿瘤，这些研究奠定了现在异体NK细胞治疗的理论基础。
如何利用合成免疫学提高免疫治疗的效果？
△图4
CAR/TCR/NKR等肿瘤感受器的合成组装
△图5
CAR是来自于抗体识别肿瘤靶点的片段，T细胞受体、NK细胞受体都是肿瘤感受器。肿瘤感受器可以跟T细胞、NK细胞、NKT细胞分别合成组装发挥效应。
感受器（senser）和发挥效应的、不同类别的细胞组合，衍生的产品种类非常丰富，在这个基础之上可以研究哪些产品适合哪些肿瘤、适合哪些肿瘤阶段。目前这个研究处于初级阶段，技术前景广阔，各类新技术将会提高“人造”抗癌效应细胞的靶向识别精度。
△图6
田志刚院士团队做过这样的实验：把针对间皮素的一个抗体片段，作为感受器装到了NK细胞表面，从图6可以看出，大幅提高了对肿瘤的治疗效果。
NK细胞的定向分化和无限量生产技术
△图7
NK细胞的定向分化和无限量生产技术，是目前领域内最大的挑战。外周血、造血干细胞和iPS等领域，也有大量的技术需要突破。
随着人们对这些细胞的发育分化过程的了解，所获得的NK细胞数量和质量会显著提升，这个领域的竞争非常激烈。
△图8
目前，田志刚院士团队的NK010细胞产品突破了符合临床标准的“三无”技术：无需预纯化、无饲养细胞、无血清培养（其中无需预纯化、无饲养细胞是针对国际竞争而言的），占领了技术高地。
无需预纯化：把外周血NK细胞纯化出来再培养（还需要丢掉部分原始种子细胞）是目前国际通用做法，但对临床来说，成本高、时间长、挑战大。
无饲养细胞：在可溶性的培养基养不出、养不好时，NK细胞要加一个饲养细胞，但饲养细胞大部分是肿瘤来源，最后作为药物作用于病患，这些并不利于后续对病人治疗的监管和药监局的管控。
△图9
图9是一位71岁老人多次化疗失败后，在田院士团队接受NK细胞治疗的记录。（开始接触这位病人是为了做安全性评价，做完评价之后病人觉得效果很明显，后续持续做了免疫治疗。）
截止2022年4月，该病人已经在田院士团队完成了12次NK细胞的免疫治疗，周期持续了38个月之久，可以看到，NK细胞的免疫治疗效果非常明显。
NK细胞的功能增效
△图10
NK细胞的功能增效（即“智能化”），赋予天然的NK细胞新的功能。可以通过基因修饰、编辑，也可以不做任何基因改造，让蛋白质附着在NK细胞膜表面（高清颗粒附着）。蛋白质不仅可以领着NK细胞去往肿瘤，还可以像自分泌一样，强化细胞的功能。
△图11
第一个例子：
图11是杀癌功能10倍强化的新型记忆性NK011细胞在人源化小鼠治疗人的肿瘤的实验记录。
在这个实验里，田院士团队在体外对NK011细胞进行模拟环境刺激，让它记住肿瘤环境后再输入小鼠体内，可以看到，细胞在肿瘤局部大量扩增、发挥强大的抗肿瘤作用，在非肿瘤区域，并没有造成太大的毒副作用。
整个实验过程并没有对NK011细胞进行基因技术改造，只是在被输病患体内之前让它记住了某些信号，这是已经成型的细胞非基因改造的后续调控。
△图12
第二个例子：
通过三特异的抗体有效联接肿瘤细胞和NK细胞，强化细胞的增效功能。三特异的抗体一头和NK细胞高亲和力结合，另外一头识别肿瘤的某个靶点，中间附着一个细胞因子，当NK细胞识别到了肿瘤后，就会把肿瘤和NK细胞、附着的细胞因子聚拢到一起（输入之前，在养好的细胞上附着三特异抗体的过程，叫做Primed）。
Armed NK细胞（也叫武装NK细胞），在动物身上治疗效果也非常好。
近期的美国临床肿瘤学会年会上， Affimed公司做的学术分享可以看到，他们研究的线路靶点与田院士团队几乎一样，只是针对肿瘤的靶点有所改变，主要针对CD30，治疗B淋巴瘤取得了100%的疗效（目前已经开展了临床试验）。
NK细胞的“普适性+定制式+货架式”供应
△图13
NK细胞成为可广泛用于病人治疗的产品的前提是建立HLA匹配细胞库（人群中接收细胞的个体与贡献细胞的个体之间的匹配）。
HLA相适细胞库需做到三个匹配（这3个匹配需要很多的经验探索，最后才能广泛地以人群中的外周血为原料来治疗病人）：
（1）通过大量实验数据，观察哪一类人不容易被病人排斥？（人的匹配）
（2）这类人的NK细胞对病人的癌细胞是否具有更强的治疗能力？（NK细胞的匹配）
（3）这类人的细胞取出来，是否最容易扩增？扩增的质量是否好？（NK细胞质量的匹配）
目前，血库中外周血的白细胞是被当做废料弃用的，只有血小板、红细胞、血浆被利用起来了，所以外周血的废物利用可以为后续的细胞治疗提供了巨大的产品来源库，做到普适性、定制式、货架式供应。脐带血的多态性远不如外周血的原料库。
而iPS是单一的细胞系来源，一个HLA的背景不可能对所有的肿瘤都适合，目前iPS解决了生产的数量问题，质量问题亟待解决。
创建“无人值守”的NK细胞工厂
△图14
中科院深圳先进技术研究院正在构建一个无人值守的实验室（它借鉴的是美国首创的无人化实验室），研究人员通过电脑输入信息、数据，无人实验室里的机器人将会根据需求开展各种实验，并将实验结果传回电脑，矫正各项信息、数据。
创建“无人值守”的NK细胞工厂是理想化的状态：
◇ 既可以根据数据库储存大量的外周血冻存，也可以根据病人的数据及时为他匹配适合的、扩增好的NK细胞；
◇ 当某种血液的库存行将用尽时，生产线会自动找到相对应的血液并启动原材料加工与储存、产品扩容与增能、成品储存与提货的流程，保证库存的充足性，攻克目前一对一式的细胞治疗和作坊化的生产方式等困难；
◇ 整个过程完全是工业化、自动化、密闭化的生产，解决细胞类产品质控难、波动范围大的难题，实现细胞的工程化、定量化。
△图15
免疫组学“人工再现”免疫卡控点
△图16
现在的免疫组学种类多样，从免疫学的角度来看，对单细胞的免疫组学最感兴趣。
因为人工再现可以知道哪一类细胞的卡控点出问题了？（在组织中所看到的免疫细胞和癌细胞之间的相互作用的界面、分子就是免疫卡控点）这个肿瘤里面有没有预存的免疫？它的记分定量是多少？有没有新的肿瘤抗原？（这些都是发现原创点的主要发源地）
就免疫耗竭而言，田院士团队发现，很多靶点要借助免疫组群人工再现组织里的现状，推测哪些靶点是最重要的，然后再去验证。（这是一个巨大的领域，发表的论文非常多。）
△图17
人体内很多天然的细胞因子可以发挥它的重要作用，但同时也存在一个弊端：当细胞因子开始发挥作用时，越有效，它产生的毒性就越大。这个毒性实际上是局部用药和全身用药的区别（细胞因子作用细胞谱的宽窄的区别）。
这个问题可以通过人工设计和合成来解决。现在的技术水平，已经可以实现通过人工设计留住细胞因子的部分功能区，剔除部分不需要的功能区，再合成新的分子。例如白细胞介素15、白细胞介素2、白细胞介素12都有成功的例子，很多已经进入临床试验阶段。
△图18
如图18，本来是NK细胞直接杀伤肿瘤，为什么中间要加一个桥联？
因为这种自由碰撞的机会和亲和力远不如利用中间的蛋白质强化杀癌效应，一头牵拉NK细胞，一头牵拉识别肿瘤的抗体，发挥出来的作用效果更强，这个就是双功能的双靶点。
肿瘤抗原太弱的话，还可以使用A、B两种抗原来识别，另外一头桥联NK细胞，这就是三功能的靶点使用。
这个领域还可以做很多新的组装和重构，例如使用NK细胞的2个靶点来牵拉NK识别肿瘤等，所以现在出现了很多新的生物大分子药物。
△图19
在过去的40年里，肿瘤疫苗一直没有大的进展，但在最近几年有新的进展：
观察图19可以看出，对比正常细胞和癌细胞的细胞膜表面，癌细胞出现了很多“新”的抗原（这个“新”抗原，与正常细胞相比，不是0和1的关系，只是密度的不同），这导致正常细胞和肿瘤细胞难以区分清楚。
细胞的随机组合，会把一个肿瘤变得比较有特性。但如何识别参与这个肿瘤的细胞有哪些？操作难度比较大，它需要通过电脑进行人工智能操作，从几百种细胞中挑选出来。
现实里的实际操作是把正常组织和肿瘤组织切下来后做比对，通过电脑计算取出其中20种做成多态的抗原，用树突状细胞loading，用疫苗激发病人的免疫力，预防肿瘤或者治疗肿瘤，目前已经有成功的个例了。（它也是典型的人工合成。）
△图20
为什么要在小鼠身上人工重建一个人的免疫系统，再给它接种上人的肿瘤？
田院士团队通过在原位上切除病人的肿瘤、再把肿瘤接种在小鼠身上进行各种各样组学的实验发现，小鼠可以很好地模拟人类肿瘤免疫微环境（目前为止还没有别的系统有它这么好的重复性）。
目前，比较高端的医学治疗，考究治疗方案（尤其是免疫治疗）对病人是否适用，会先将病人的肿瘤组织接种到小鼠身上做实验性治疗，治疗效果好就给他使用这个方案。这个方法的造价更高，但更合理、更有效、更有预测性，也是未来发展的一个主要方向。
△图21
总结：
对比T细胞，NK细胞是后起之秀，有可能后来居上。
基于NK细胞的免疫治疗，主要有两大路径：
一是使用NK细胞输注治疗，补充NK细胞的缺陷，实现NK细胞扩增与功能增效；
二是通过抗体类的药物，恢复体内NK细胞功能。
这两大路径使用的是不同的药物，一个是输注细胞，一个是蛋白质药物，但殊途同归，使用的NK细胞原理是一样的，目的也是一样的。这两大路径既可以独立发展，也可以相互配合。
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