Nature子刊 | 中山大学梁欢欢/刘迎芳揭示流感聚合酶在转录和复制周期之间平稳切换的机理
流感聚合酶(FluPol)在病毒生命周期开始时转录病毒mRNA，并在病毒蛋白质合成后启动基因组复制。然而，人们对FluPol如何在转录和复制状态之间切换仍然知之甚少，特别是考虑到这两种功能的结构基础根本不同。
2023年7月24日，中山大学梁欢欢及刘迎芳共同通讯在Nature Structural & Molecular Biology (IF=17)在线发表题为“An intermediate state allows influenza polymerase to switch smoothly between transcription and replication cycles”的研究论文，该研究表明FluPol通过一种以前未研究过的构象(称为“中间状态”)在转录和复制周期这两种状态之间实现功能切换。
利用冷冻电子显微镜，该研究获得了H5N1 FluPol在3.7 Å处的中间状态结构，其特征是一个阻断的帽结合域和一个收缩的核心区域。结构分析结果表明，中间状态可能允许FluPol顺利过渡到转录或复制状态。此外，该研究发现中间状态的形成对于FluPol的转录和复制活性都是必需的，FluPol的转录和复制周期是通过这种中间状态调节的。
在原核和真核细胞中，基因组的复制和转录分别由DNA聚合酶和RNA聚合酶进行。然而，这种独特的功能是由流感病毒中自编码病毒RNA (vRNA)依赖的RNA聚合酶完成的，称为流感RdRp或FluPol，它由亚基PA、PB1和PB2组成。流感病毒基因组通过病毒核蛋白(NPs)的多个拷贝与FluPol一起包装成8个核糖核蛋白(RNPs)。据报道，FluPol在感染早期优先合成病毒mRNA以生产病毒蛋白。一旦新合成的病毒蛋白积累，FluPol逐渐切换到基因组复制模式。
FluPol由一个中心RNA聚合酶区域(核心区域)组成，该区域被几个辅助结构域包围。RNA合成的核心区域由PA的C端结构域(PA-C)、PB1和PB2的N端结构域(PB2-N)组成，辅助区域由PA的N端结构域(PA-N)和PB2的C端结构域(PB2-C)组成，而辅助结构域由PA(PA-N)的N端结构域和PB2(PB2-C)的C端结构域组成，由Lid、Mid和Cap结合结构域、含有残基K627的结构域(627结构域)和核定位序列(NLS)结构域组成。最近，对FluPol的新结构研究促进了对其转录和复制机制的理解。这些结构表明，FluPol通过旋转、翻译和排列PA-N和PB2-C结构域显示了其功能的高度结构灵活性，而核心区被认为是相对稳定的。
中间状态对聚合酶的活性至关重要（图源自Nature Structural & Molecular Biology ）
FluPol的结构灵活性已经在其转录状态(T状态)的每个步骤中得到说明，包括预起始、起始、延伸、终止和再循环阶段。在起始前结构中，PB2-C的627结构域与核心区紧密结合。此外，帽结合结构域暴露，有利于结合由聚合酶II (Pol II)提供的宿主细胞mRNA的5 '帽。为了实现“cap-snatching”功能，FluPol在PB2-C和PA-C中有一系列连续的结合位点，用于Pol II的C端(Pol II CTD)。PA-N和帽结合结构域之间的协作对于FluPol启动转录非常重要。PA-N的内切酶活性位点位于帽结合位点的对面，两者之间的距离约为50 Å，足以使PA-N产生长度约为10-15个核苷酸(nt)的寡核苷酸引物。为了启动转录，帽结合域向PB1的催化腔旋转~70°，引导引物延伸到催化中心。此外，据报道，在转录过程中，游离的424环将带帽引物引导至聚合酶的催化通道。随着新合成mRNA的延伸，启动环被挤出，模板退出通道打开。在终止过程中，FluPol在从5 '末端的U17位置开始的oligo(U)基序上结巴，并产生poly(A)尾巴。
与带帽RNA引发的转录起始不同，FluPol通过重新合成二核苷酸pppApG来启动复制。先前的研究表明，至少需要两个FluPol(一个复制FluPol(复制酶)和一个募集FluPol(封装FluPol))来启动复制过程。值得注意的是，vRNA结合的复制酶使用vRNA作为模板负责新生互补RNA (cRNA)的产生，而没有模板结合的封装FluPol可以防止cRNA产物被宿主因子降解。宿主因子ANP32A被鉴定为FluPol复制所必需的。在ANP32A介导的FluPol二聚体的结构中，复制酶的结构不同于T状态下的FluPol。复制酶的627结构域离核心区较远。这种结构有利于ANP32A的招募，但不利于Pol II CTD的加载。更重要的是，复制酶的Mid结构域部分插入到cap结合域的活性口袋中，从而阻断5 ' -capped RNA的结合。同时，PA-N在原位旋转~90°，面向帽结合结构域的相反方向。处于复制状态(R状态)的FluPol无法执行“cap-snatching”。因此，很明显，FluPol采用根本不同的构象来启动转录和复制周期。
该研究提出了一种机制，通过这种机制，FluPol通过一种以前未研究过的构象(称为“中间状态”)在这两种状态之间实现功能切换。该研究为FluPol在病毒生命周期中如何协调转录和复制提供了解释。由于FluPol被认为以低能态存在，可能在包装成病毒的RNP中被激活，研究人员假设FluPol的这种中间状态反映了静息RNP中构成的状态。
来源：iNature
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