清华大学董晨院士团队，最新Science Immunology！

肿瘤免疫治疗是否能发挥疗效，与抗原特异性CD8⁺ T细胞经历的“T细胞耗竭”密切相关。日前，中国科学院院士、免疫学专家董晨教授带领研究团队在权威期刊Science Immunology发表论文，详细阐述了在T细胞衰竭过程中，两条信号通路TGF-β-BCL6和IL-2-BLIMP1信号通路调控抗肿瘤CD8⁺ T细胞分化的分子机制，为开发新型的抗肿瘤T细胞过继疗法、细胞因子疗法和免疫检查点阻断联合疗法提供了重要指导。

研究人员介绍，在肿瘤的发生发展过程中，抗原特异性CD8⁺ T细胞首先在引流淋巴结（Tumor-draining lymph nodes, TDLNs）中被持续性的肿瘤抗原激活，并分化成为干细胞样耗竭型T细胞（Stem-like/Progenitor exhausted T cells, 简称T_prog cells），进而迁移到肿瘤微环境中，大量发育成为终末分化的耗竭型T细胞（Terminally differentiated exhausted T cells, 简称T_term cells）。T_prog细胞被认为是响应免疫检查点抑制剂（如PD-1阻断剂）的主要细胞。

新工作探究了这一过程中的细胞外信号和细胞内转录调控机制，包括如何控制T_prog细胞的生成并使其在肿瘤微环境中持续存在。

▲T细胞衰竭过程的分子调控机制示意图（图片来源：研究团队提供）

董晨院士团队此前的工作曾报道，转录因子BCL6在调控辅助性T细胞（Tfh）发育中起重要作用。同时，BCL6也是调控生发中心B细胞分化以及生发中心反应的关键转录因子。在病毒感染模型中，BCL6对于记忆型CD8⁺ T细胞和滤泡杀伤性CD8⁺ T细胞的发育十分重要。

此次，研究团队聚焦于CD8⁺ T细胞，研究了转录因子BCL6的表达、功能和调控机制。

图片来源：123RF

通过分析癌症患者的单细胞转录组测序数据，研究人员发现，BCL6在肿瘤浸润的CD8⁺ T_prog细胞中高表达。进一步利用小鼠淋巴瘤和黑色素瘤模型验证，发现BCL6同样特异性地高表达在TDLN和肿瘤浸润的CD8⁺ T_prog细胞中。此外，在肿瘤发生阶段的TDLN中，BCL6不表达在幼稚型和激活的CD8⁺ T细胞中；而当肿瘤进展到第9天，BCL6的表达被显著诱导在耗竭的TOX⁺TCF1⁺ CD8⁺ T_prog细胞中。随着肿瘤微环境的形成，T_prog细胞迁移至肿瘤中并进一步分化成为TOX⁺TCF1^-BCL6^- CD8⁺ T_term细胞。这些结果表明，BCL6的表达标志着肿瘤特异性T_prog细胞的形成。

此外，利用谱系追踪系统验证，在肿瘤的发展过程中，肿瘤浸润的BCL6⁺ T_prog细胞能够持续分化成为T_term细胞，并是维持肿瘤浸润CD8⁺ T细胞数量的关键T细胞亚群。

接下来，研究团队详细分析了BCL6的功能。作者分别将野生型和BCL6缺失的幼稚型肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞过继输送至荷瘤小鼠体内，发现BCL6的缺失显著增强了T细胞对肿瘤生长的控制效果。在第16天，BCL6的缺失导致T_term细胞的比例显著升高，并导致肿瘤浸润抗原特异性CD8⁺ T细胞的数量显著增加，尤其是T_term细胞的数量，而T_prog细胞的数量没有显著变化。

进一步将野生型和BCL6缺失的肿瘤浸润T细胞过继输送至第二个荷瘤小鼠体内，则发现BCL6的缺失显著损害了抗原特异性T细胞对肿瘤生长的持续控制能力，并导致TDLN和肿瘤浸润T细胞数量显著减少，T_prog细胞亚群近乎消失。这说明，BCL6对于CD8⁺ T细胞的长期抗肿瘤能力十分重要，并在T_prog细胞的长期维持（而不是产生）中不可或缺。

为了探究BCL6在T_prog细胞应对二次肿瘤挑战中的作用，研究人员将TDLN中的WT和BCL6缺失的T_prog细胞过继输送至第二个荷瘤小鼠，发现BCL6的缺失显著损害T_prog细胞的抗肿瘤效果，并导致肿瘤浸润抗原特异性T细胞的数量显著降低，T_prog细胞的比例显著降低。这说明，BCL6对于T_prog细胞应对长期肿瘤挑战十分重要。同时，BCL6对于肿瘤特异性T_prog细胞的维持主要发生于肿瘤微环境，而对TDLN中T_prog细胞的产生和维持无显著调控作用。

接下来，研究人员探究了在CD8⁺ T细胞中诱导BCL6表达的上游信号。体外筛选结果显示，TGF-β和IL-2的中和抗体能够显著诱导BCL6在CD8⁺ T细胞的表达。

在TGF-β通路中，敲除Tgfbr2导致TGF-β无法诱导BCL6在体外培养的CD8⁺ T细胞中的表达。一致地，在淋巴瘤小鼠模型中，Tgfbr2缺失导致肿瘤浸润的TCF1⁺BCL6⁺ T_prog细胞的比例显著降低；随着肿瘤进展，Tgfbr2缺失还导致TCF1⁺BCL6⁺ T_prog细胞亚群近乎消失。这些结果说明，TGF-β是维持肿瘤模型中BCL6表达和Tprog细胞亚群的关键细胞因子。

在肿瘤进展过程中，Tgfbr2的缺失导致肿瘤浸润抗原特异性T细胞在第16天数量显著增多，而在第24天显著减少。这又显示了TGF-β双面性的调控作用：一方面它显著抑制CD8⁺ T细胞的增殖，一方面它在其长期生存中不可或缺。

通过ChIP-seq和ChIP-qPCR探究TGF-β调控BCL6表达的分子机制则发现，TGF-β的下游分子SMAD2显著结合在Bcl6基因的启动子区域。体外实验显示，SMAD2的缺失显著减弱TGF-β对BCL6表达的诱导能力，说明TGF-β-SMAD2信号通路可能直接转录诱导BCL6在CD8⁺ T细胞中的表达。

上述结果显示了TGF-β-SMAD2通路上调CD8⁺ T细胞中的BCL6表达。

另一方面，有关IL-2通路的影响，研究人员首先通过体外实验看到，IL-2受体CD25缺失的CD8⁺ T细胞中，BCL6的表达显著升高。一致地，在小鼠肿瘤模型中，CD25缺失导致肿瘤浸润抗原特异性T细胞几乎全部维持为TCF1⁺BCL6⁺ T_prog细胞，而无法分化成为TCF1^-TIM-3⁺ T_term细胞。同时，肿瘤浸润抗原特异性细胞的数量，尤其是T_term细胞的数量显著降低，说明IL-2是T_term细胞发育的关键细胞因子。

分子机制上，IL-2的下游分子STAT5显著结合到Bcl6基因的启动子区域，阻断STAT5的功能可显著诱导BCL6在CD8⁺ T细胞中的表达，说明IL-2-STAT5信号通路可能直接转录抑制BCL6在CD8⁺ T细胞中的表达。

而ChIP-qPCR结果显示，IL-2和TGF-β分别显著减弱SMAD2和STAT5在Bcl6的同一启动子位点的结合，说明TGF-β-SMAD2信号通路和IL-2-STAT5信号通路可能通过竞争性结合到该位点拮抗性地调控BCL6的表达。

作为转录因子，BCL6调节一系列基因的表达。研究作者通过整合Bcl6过表达的RNA-seq数据和BCL6在CD8⁺ T细胞中的ChIP-seq数据发现，在CD8⁺ T细胞中，BCL6直接转录诱导一系列T_prog特征基因的表达，并转录抑制一系列T_term特征基因的表达。

与另一种转录因子TCF1相比，该研究发现Bcl6和Tcf7过表达均显著提高肿瘤浸润T_prog细胞的比例，然而Bcl6的过表达抑制T细胞增殖，导致肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的数量显著减少，其中T_prog和T_term细胞的数量均显著减少；而Tcf7的过表达则不影响T细胞的增殖及其数量，导致T_prog细胞数量显著增加，T_term细胞数量显著减少。此外，在TCF1缺失的条件下，Bcl6过表达仍能增加T_prog细胞的比例；但在BCL6缺失时，Tcf7过表达无法改变T_prog细胞的比例，但能显著增加CD8⁺ T细胞的数量。

ChIP-seq结果还显示，BCL6和TCF1具有不同的DNA结合谱。同时，TCF1显著结合到Bcl6的基因位点，而反之则不。这些结果说明，BCL6是TCF1的下游分子，二者具有非冗余的调控功能：BCL6特异性抑制T_prog细胞向T_term细胞的分化，同时显著抑制T细胞的增殖；而TCF1则特异性调控T细胞的生存能力。

在B细胞和CD4⁺ T细胞中，BLIMP1是拮抗BCL6的关键转录因子。那么，BLIMP1在肿瘤特异性CD8⁺ T细胞中的作用是如何的呢？

ChIP-seq结果显示，BCL6和BLIMP1具有不同的DNA结合谱。RNA-seq数据显示，Bcl6和Prdm1的过表达诱导产生负相关的CD8⁺ T细胞转录组特征。同时，BLIMP1直接转录抑制一系列T_prog特征基因的表达，并直接转录诱导一系列T_term特征基因的表达。另外，体外实验结果表明，BLIMP1通过响应IL-2信号显著诱导TIM-3⁺ T_term细胞的分化。一致地，Prdm1缺失和过表达的体内实验结果表明，BLIMP1是促进肿瘤浸润T_prog细胞分化成为T_term细胞的关键转录因子。另外，Bcl6和Prdm1单独过表达和双过表达的实验结果进一步显示，BCL6和BLIMP1互逆调控T_prog/T_term特征基因的转录，进而拮抗调控T_prog向T_term细胞分化的过程。 

由于Bcl6过表达或者Prdm1缺失都产生更高比例的T_prog细胞亚群，研究人员进一步探究，它们能否和PD-L1/PD-1阻断疗法产生协同性的抗肿瘤效果。分析结果显示，Bcl6过表达显著损害抗原特异性T细胞的抗肿瘤能力，且无法和抗PD1阻断剂联用产生更有效的肿瘤控制效果。同时，抗PD1阻断剂无法有效促进Bcl6过表达的T_prog细胞的扩增和分化。

不同的是，Prdm1缺失的抗原特异性T细胞的过继输送和抗PD1阻断剂产生最佳的抗肿瘤效果，显著优于单独使用抗PD1阻断剂。流式数据显示，抗PD1阻断剂能够显著诱导肿瘤浸润的Prdm1缺失的T_prog细胞的扩增和分化。

在Science Immunity同期发表的评论文章中，专家总结说，BCL6作为“检查点”，让T_prog细胞和T_term细胞之间保持微妙的平衡，这对于高效的免疫检查点抑制剂应答至关重要，这些结果为临床应用提供了价值。 

清华大学医学院基础医学系直博生孙勤利为该论文的第一作者，上海免疫治疗创新研究院和西湖大学董晨院士为本文的通讯作者，其他参与人员包括清华大学免疫研究所和上海市免疫治疗创新研究院的实验室成员。本研究得到了来自国家自然科学基金委员会、国家重点研发项目、新基石科学基金会、上海本土高水平大学创新研究团队、上海市科学技术委员会、和毕诺济公司等多个项目的支持。

   

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