Nature：被忽略百年的发现 - 脑细胞脂肪滴堆积竟是阿尔茨海默病“元凶”

2024-06-08 00:06

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Bringing medical advances from the lab to the clinic.

关键词：AD；APOE4/4基因型；小胶质细胞；Nature

1906年，德国精神科医生阿洛伊斯·阿尔茨海默（Alois Alzheimer）首次报告了一例具有进行性痴呆表现的患者，她伴有短时记忆丧失、认知功能障碍等症状。这也就是后来以他名字命名的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）。

在该患者去世后Alois Alzheimer解剖其大脑发现了β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和Tau蛋白缠结。在后续多年的研究里，斑块与缠结这两个病理特征成为AD研究领域的重点关注对象。目前绝大多数致力于预防或减缓AD进展的药物开发大多集中在减少或消除斑块和缠结，但成功者屈指可数。

事实上，在AD患者的大脑中，除了经典的斑块和缠结外，Alois Alzheimer当初还注意到患者脑细胞（小胶质细胞）中的异常脂肪滴堆积。然而，在此后的上百年时间里，这种胶质细胞与脂质（glial-lipid）的病理特征在很大程度上被忽视了。

脂质代谢不仅在维持细胞膜的完整性和功能中发挥重要作用，而且与炎症反应、细胞信号传导以及神经保护和损伤等多个方面密切相关。在AD的背景下，特定的脂质代谢途径可能被激活，导致有害的脂质积累，进而影响神经细胞的功能和存活。

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，它们在维持大脑稳态、清除病原体和代谢废物、以及对损伤反应中起着至关重要的作用。在AD等神经退行性疾病中，小胶质细胞的激活状态和功能可能发生改变，它们的行为可能从神经保护转变为神经毒性。

2024年3月13日，来自美国斯坦福大学医学院Tony Wyss-Coray教授团队在国际顶尖学术期刊Nature上发表了一篇题为“APOE4/4 is linked to damaging lipid droplets in Alzheimer’s disease microglia”的研究论文【1】。

该研究通过对AD患者脑组织的单核RNA测序，发现了一种由脂滴相关酶ACSL1的表达所定义的小胶质细胞状态，其中ACSL1阳性的小胶质细胞在APOE4/4基因型AD患者中最为丰富。

该研究表明，APOE4/4基因型与AD中小胶质细胞的脂质滴积（Lipid Droplet，LD）累有关，这可能通过APOE依赖的方式促进Tau蛋白磷酸化和神经毒性，为AD的治疗提供了新的策略。

（如需原文，请加微信healsanq获取，备注20240313Nature）

主要研究内容和结果

本研究主要探讨了AD中APOE4/4基因型与小胶质细胞脂质滴积累之间的关系，并评估了这种积累对神经毒性的影响。研究结果揭示了APOE4/4基因型与AD患者小胶质细胞中脂质滴的显著积累有关，并且这种积累与Tau蛋白磷酸化和神经毒性存在联系。

1. AD中的脂质相关ACSL1小胶质细胞

为了研究死后AD患者脑组织与APOE基因型的关系，本研究对APOE4/4基因型AD患者、APOE3/3基因型AD患者以及年龄和性别匹配的APOE3/3基因型对照患者的新鲜冷冻额叶皮质组织进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（图1）。对照组和AD-APOE4/4小胶质细胞的差异基因表达分析显示，差异表达最显著的基因是酰基辅酶a合成酶长链家族成员1（ACSL1），其负责编码一种脂质合成酶，是LD生物合成的关键酶，过表达ACSL1能够在多种细胞中诱导甘油三酯特异性LD的合成。与对照组相比，ACSL1在AD患者脑组织的小胶质细胞中特异性上调；与AD-APOE3/3组相比，在APOE4/4中上调幅度更大。对所有小胶质细胞进行亚聚类显示，ACSL1小胶质细胞构成与稳态和疾病相关小胶质细胞（DAM）状态不同，前者含有更多代谢状态调节因子（如NAMPT和DPYD）的共表达。由于ACSL1小胶质细胞簇中含有一组LD相关基因，故称其为LDAM，其中AD-APOE4/4脑组织中LDAM水平最高，其次是 AD-APOE3/3，在年龄匹配的对照脑组织中LDAM比例最低。

图1. 研究发现了一类特殊的小胶质细胞，其表达ACSL1且脂质合成活跃

2. 脂质累积与AD病理发展相关

为了测量细胞内脂质积累，研究人员对AD和对照脑切片进行油红O染色。研究发现，AD-APOE4/4患者的大脑中显示出丰富的核周油红O脂质体，类似于LD（图2）。与AD-APOE3/3的个体相比，AD-APOE4/4个体的脂质体略有增加但并不显著。油红O细胞通常在Aβ斑块附近或核心处发现。类似的，ACSL1小胶质细胞经常在Aβ斑块附近观察到，这提示斑块附近含有脂质体的细胞可能是ACSL1小胶质细胞。由此证实脂质积累与AD病理有关。

通过简易精神状态检查（MMSE）测量，脂质体数量与认知表现呈负相关，而与Aβ斑块数量和Tau病理水平呈正相关。将基因表达与脂质体丰度关联分析发现，小胶质细胞ACSL1的表达与脂质体的相对数量呈正相关。

图2. 脂质累积与AD病理发展相关

3. 纤维状淀粉样蛋白-β（fAβ）诱导ACSL1表达、甘油三酯合成和脂滴积累

为了直接检测APOE基因型是否与小胶质细胞LD积累有关，研究人员构建了APOE4/4和等基因APOE3/3 iPS细胞分化的小胶质细胞（iMG）。显微镜观察发现，与APOE3/3 iMG相比，APOE4/4 iMG中LD的积累更多。然而，用fAβ处理iMG能够诱导LD积累的显著增加，而APOE4 AD风险等位基因的存在加剧了LD的积累，但在APOE-KO背景下，fAβ对LD积累无影响。LD相关基因PLIN2和ACSL1的表达也呈现相似的变化，并在APOE4/4个体中变化更为显著。随后，用fAβ处理原代大鼠小胶质细胞、原代人巨噬细胞和小鼠BV2小胶质细胞系也同样观察到LD的积累。透射电子显微镜还显示fAβ处理后的iMG中LD浓度增加。为了确认fAβ处理后APOE不同基因型之间的脂质积累差异，对fAβ处理的iMG进行相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像分析，研究结果表明LD光谱与不饱和（甘油三酯）光谱重叠。进一步脂质组学分析显示这些脂质是响应fAβ而从头合成的。全基因组CRISPR-KO筛选显示甘油三酯代谢调节因子是LD积累所需的最重要的基因类别，其中ACSL1是LD形成所需的最重要基因之一。ACSL1抑制剂（Triacin C）在fAβ处理的细胞中逆转了APOE4/4 iMG中LD的积累。

为了评估LD积累的小胶质细胞的转录组学和表观遗传状态，研究人员对高LD和低LD iMG进行了FACS流式分选，然后进行了ATAC-seq和RNA-seq。ATAC-seq结果表明，与低LD小胶质细胞相比，高LD小胶质细胞特异性富集NF-κB家族转录因子（如REL和ETV6）相关的基序。RNA-seq结果表明，高LD小胶质细胞的NF-κB相关的促炎细胞因子（如TNFα和IL-1B）的表达较高，而小胶质稳态标志物的表达较低。含LD的APOE4/4 iMG的表型测量表明，它们在吞噬作用中功能失调，溶酶体积聚并分泌炎症相关趋化因子。这些结果与最近报道的具有功能失调和炎症性小胶质细胞状态的小鼠LDAM相似。

图3. Aβ处理后，iMG增加ACSL1表达、甘油三酯合成和脂滴积累

4. LD iMG诱导Tau磷酸化和神经毒性

为了研究LDAM对神经元的影响，将APOE4/4 iMG用流式分选为高LD和低LD，分别在神经基础培养基中培养12h，形成条件培养基，用其培养APOE4/4 iPS细胞来源的人神经元。研究结果显示，仅高LD iMG条件培养基能够诱导iPS细胞来源的神经元中的高浓度pTau，而低LD iMG条件培养基诱导的pTau浓度与未处理组相似。当使用APOE3/3和APOE4/4 iPS细胞来源的iMG条件培养基处理人类神经元时，这种效果相似，但当使用APOE-KO iMG条件培养基时，这种效果不存在。同样，来自APOE3/3和APOE4/4 iMGs的条件培养基具有较高浓度的LDs诱导人神经元中的半胱天冬酶激活，而来自APOE-KO iMG的条件培养基则没有影响。

有趣的是，利用高LD条件培养基处理的人类神经元显示LipidSpot染色增加。进一步脂质组学分析显示，暴露于高LD条件培养基的iPS细胞衍生的神经元含有高浓度的甘油三酯脂类，这些脂类在fAβ刺激下积聚在iMG中。