Cell：重大进展！新型线粒体碱基编辑器成功开发！线粒体基因组编辑的新时代来临

在一项新的研究中，来自韩国基础科学研究所（IBS）基因组工程中心的研究人员开发出一种新的基因编辑平台，称为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（transcription activator-like effector-linked deaminase, TALED）。TALED是能够在线粒体中进行A→G碱基转换的碱基编辑器。这一发现是几十年来治疗人类遗传疾病的一个高潮，而且TALED可以被认为是基因编辑技术中最后一块缺失的拼图。

从1968年第一个限制性内切酶的鉴定，1985年聚合酶链式反应（PCR）的发明，到2013年CRISPR介导的基因组编辑的展示，生物技术的每一个新的突破性发现都进一步提高了我们操纵DNA这个生命蓝图的能力。特别是最近开发的称为CRISPR-Cas系统的基因剪刀，使我们能够对活细胞进行全面的基因组编辑。这为通过编辑我们基因组中的突变来治疗以前无法治愈的遗传疾病提供了新的可能性。

虽然基因编辑在细胞核基因组方面基本上是成功的，然而，科学家们在编辑也有自己的基因组的线粒体方面却没有成功。线粒体，即所谓的“细胞的能量工厂”，是细胞中的微小细胞器。由于它是能量代谢的重要细胞器，如果基因发生突变，就会引起与能量代谢有关的严重遗传疾病。

论文通讯作者、IBS基因组工程中心主任Kim Jin-Soo解释说，“有一些极其讨厌的遗传疾病是由于线粒体DNA的缺陷而产生的。例如，导致双眼突然失明的莱伯遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）是由线粒体DNA的一个简单单点突变引起的。”另一种与线粒体基因有关的疾病是线粒体脑肌病伴乳酸中毒和中风样发作（mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes, MELAS），它慢慢地破坏了患者的大脑。一些研究甚至表明，线粒体DNA的异常也可能是退行性疾病的原因，如阿尔茨海默病和肌肉萎缩症。

线粒体基因组是由母系遗传的。线粒体DNA有90个已知的致病性点突变，每5000人中至少有1人会发生这类突变。由于对线粒体的递送方法的限制，许多现有的基因组编辑工具无法使用。例如，CRISPR-Cas平台不适用于编辑线粒体中的这类突变，因为向导RNA（gRNA）无法进入这种细胞器本身。

Kim补充说，“另一个问题是，这些线粒体疾病的动物模型很匮乏。这是因为目前不可能设计出构建动物模型所需的线粒体突变。缺乏动物模型使得开发和测试这些疾病的治疗方法非常困难。”

因此，对线粒体DNA（mtDNA）进行编辑的可靠技术是基因组工程的最后前沿之一，为了征服所有已知的遗传疾病，必须进行探索，而世界上很多科学家们多年来一直努力使之成为现实。

2020年，由布罗德研究所的David R. Liu领导的一个研究团队构建出一种名为DddA衍生性胞嘧啶碱基编辑器（DddA-derived cytosine base editor, DdCBE）的新型碱基编辑器，可以在线粒体DNA中进行C→T转换。这是通过构建一种称为碱基编辑的新基因编辑技术而实现的，该技术在不破坏DNA的情况下将一个核苷酸碱基转换为另一个核苷酸碱基。然而，这种技术也有其局限性。它不仅局限于C→T转换，而且大多局限于TC基序，使它实际上成为TC→TT转换器。这意味着它只能纠正90个确认的致病性线粒体点突变中的9个（10%）。在很长一段时间里，线粒体DNA的A→G转换被认为是不可能的。

论文第一作者Cho Sung-Ik说，“我们开始思考如何克服这些限制。结果就是我们能够构建出一种名为TALED的新型基因编辑平台，可以实现A→G转换。我们的新型碱基编辑器极大地扩展了线粒体基因组编辑的范围。这不仅可以为制作疾病模型，而且可以为开发治疗方法做出巨大贡献。”值得注意的是，仅仅能够在人类mtDNA中进行A→G转换，就可以校正90个已知致病性突变中的39个（=43%）。

这些作者通过将三个不同的组件融合在一起构建出TALED。第一个组件是转录激活因子样效应物（TALE），它能够靶向DNA序列。第二个组件是TadA8e，它是一种促进A→G转换的腺嘌呤脱氨酶。第三个组件是DddAtox，它是一种胞嘧啶脱氨酶，使DNA更容易被TadA8e访问。

图片来自Cell, 2022, doi:10.1016/j.cell.2022.03.039。

TALED的一个有趣的方面是TadA8e有能力在拥有双链DNA（dsDNA）的线粒体中进行A→G编辑。这是一个神秘的现象，因为TadA8e是一种已知只对单链DNA（ssDNA）具有特异性的蛋白。

Kim说，“以前没有人想到用TadA8e在线粒体中进行碱基编辑，因为它应当只对单链DNA具有特异性。正是这种跳出框框的思维方式，真正帮助我们发明了TALED。”

这些作者推测，DddAtox允许dsDNA通过瞬时解开双链而被访问。这个转瞬即逝但短暂存在的时间窗口允许超级快速作用的TadA8e迅速进行必要的编辑。除了调整TALED的组件外，他们还开发了一种能够同时进行A→G和C→T碱基编辑以及仅进行A→G碱基编辑的技术。

这些作者通过构建出含有所需mtDNA编辑的单细胞衍生克隆来展示了这种新技术。此外，他们发现TALED既没有细胞毒性，也不会引起mtDNA的不稳定。此外，在细胞核DNA中没有不良的脱靶编辑，在mtDNA中也很少有脱靶效应。他们如千斤的目标是通过提高编辑效率和特异性来进一步改进TALED，最终为校正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者的致病性mtDNA突变铺平道路。他们还专注于开发适用于叶绿体DNA的A→G碱基编辑的TALED。叶绿体DNA编码植物光合作用中的重要基因。

IBS科学传播者William I. Suh称赞道，“我认为这一发现的意义堪比2014年获得诺贝尔奖的蓝色LED的发明。就像蓝色发光二极管（LED）是让我们拥有高能效的白光LED光源的最后一块拼图一样，预计TALED将迎来基因组工程的新时代。”

参考资料：

1. Sung-Ik Cho et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell, 2022, doi:10.1016/j.cell.2022.03.039.

2. A new era of mitochondrial genome editing has begun
https://www.ibs.re.kr/cop/bbs/BBSMSTR_000000000738/selectBoardArticle.do?nttId=21220&pageIndex=1&searchCnd=&searchWrd=