深度探讨乳腺癌中HER2表达模式（下篇）

HER2是乳腺癌领域探索靶向治疗生物标志物的最成功案例，基于“癌基因成瘾”的概念，即某些肿瘤细胞依赖于某一个持续激活的致癌信号通路来维持其恶性增殖存活的现象，使得识别出从抗HER2治疗药物中获益的患者成为可能。由于HER2基因扩增导致细胞膜上HER2受体明显过表达，使用经临床验证的抗体和基于细胞膜表面受体表达强度和完整性的评分系统进行免疫组织化学（IHC）检测，构成了区分HER2阴性（IHC评分0/1+）和阳性（IHC评分3+）肿瘤的筛选方法，同时能够识别出HER2蛋白完整但仅中度表达的肿瘤（IHC评分2+，待明确），而这需要从基因状态方面进一步研究，以证实其与“癌基因成瘾”存在相关性。

发表在《Pathobiology》上的一篇综述报道^[1]中，从经典的HER2评估到HER2表达不常见和/或难以定义的模式均进行了详细描述，并且结合理论与实践，重点阐述了HER2异质性、HER2在新辅助治疗后丢失或从原发性乳腺癌向复发性/转移性乳腺癌的演变过程中发生转化以及HER2低表达乳腺癌新类别的相关内容。在上篇报道中（深度探讨乳腺癌中HER2表达模式（上篇）），已经重点介绍了HER2表达模式、HER2异质性以及计算病理学应用于HER2评估的相关内容，现将该综述中有关HER2低表达乳腺癌新类别以及HER2表达状态在肿瘤疾病演变过程中或者新辅助治疗前后发生变化、检测前阶段及其针对不同类型组织样本中HER2表达评估的影响等相关内容梳理如下，以飨读者。

乳腺癌新类别—HER2低表达

目前的研究数据表明，HER2低表达乳腺癌患者可以从新一代ADC药物治疗中获益。由于HER2低表达表现出一定程度HER2蛋白表达，但并不携带HER2基因扩增（图6）。因此，HER2低表达不属于“HER2成瘾”肿瘤，而是“HER2-equipped”或“HER2-scaffolded”肿瘤。细胞膜上表达的HER2受体似乎足以通过与抗HER2抗体的特异性结合（HER2受体在此处作为简单的载体）支持细胞毒性药物的递送。

根据当前的评分系统，HER2低表达乳腺癌定义为HER2评分1+或评分2+且ISH结果为阴性的肿瘤。HER2低表达肿瘤占总体乳腺癌的55%，估计65-83%的病例为HR阳性，其余为HR阴性。一项比较原发性与复发性病灶之间HER2状态的研究观察到15%的HER2 0肿瘤转化为HER2低表达，14%的HER2低表达转化为HER2 0。在原发性和复发性肿瘤中，HER2低表达状态分别占34%和38%^[7]。

图6. 乳腺癌中HER2过表达的IHC谱

在没有潜在HER2基因扩增的情况下却存在HER2蛋白表达的原因尚未明确，但HER2拷贝数增加可以解释这一现象。此外，在无HER2基因扩增的情况下，化疗和放射治疗或表观遗传学变化诱导的NF-kB通路活化诱导的HER2上调与HER2表达增加相关。此外，据报告，HER2和雌激素受体通路之间的串扰或治疗适应或耐药引起的修饰可上调HER2蛋白水平^[8]。

在两项回顾性分析中，Schettini^[9]和Agostinetto等^[10]研究了HER2低表达乳腺癌的分子和病理特征及预后影响。Schettini回顾性收集了来自不同研究的13个公开数据集的临床病理学和PAM50基因表达数据，共纳入3689例已知IHC和HER2扩增状态的HER2阴性乳腺癌。研究目的在于首次描述HER2低表达乳腺癌的特征，并比较HER2低表达和HER2 0疾病的特征。结果发现HER2低表达肿瘤与更大的肿瘤大小和更多的淋巴结受累相关，且大部分为HR阳性。Luminal A是最常见的固有亚型，其次是Luminal B。在HR阳性疾病中，与HER2评分为0的癌症相比，HER2低表达患者表现出更高水平的HER2 mRNA水平。未观察到HER2低表达和HER2评分为0的癌症之间的OS差异^[9]。

为了进一步阐明HER2低表达特征，Agostinetto对来自癌症基因组图谱(TCGA)的更均一的数据进行了回顾性分析，包括1097例已知HR和HER2状态的原发性乳腺癌。研究者发现HER2低表达肿瘤大部分为HR阳性，且多为Luminal A型，与既往研究报道一致。并且观察到HR阳性/HER2低表达患者的HER2 mRNA水平高于HR阴性/HER2低表达肿瘤患者。未观察到HER2低表达和非HER2低表达患者之间的无进展间期、无病间期和OS存在统计学显著差异^[10]。

在最近的一项分析中，Denkert等人^[11]比较了HER2低表达和HER2 0乳腺癌的临床和分子特征，并且特别关注患者接受新辅助治疗后的反应。除了证实HR阳性肿瘤中HER2低表达疾病的患病率较高外，研究者还检测到HER2低表达/HR阳性患者的pCR率低于HER2 0/HR阳性患者，但在HR阴性疾病中未发现显著差异。另一方面，与HER2 0/HR阴性患者相比，HER2低表达/HR阴性患者的无病生存期(DFS)和OS更长，但HR阳性乳腺癌患者并非如此。

基于目前可用的数据，HER2低表达是否可以作为乳腺癌的一个独特亚型，目前尚无定论。“HER2低表达”定义可能代表一个涵盖性术语，包括具有不同程度HER2（过度）表达的不同类型乳腺癌。然而，基于新型ADC药物在HER2低表达乳腺癌中的显著获益，有必要确立HER2低表达的临床治疗分型地位。

需要强调的是，目前，HER2 IHC检测技术不应改变或适应于能够检测HER2低表达肿瘤。如上所述，HER2低表达的定义仍依赖于目前基于传统IHC染色方案的IHC评分系统。其中的挑战在于评分的可重复性，这反过来可能存在技术问题，包括检测前影响因素。在这方面，质量保证方案极其重要。值得注意的是，一些国家专家组，如法国GEFPICS小组，已经在其准则和质量保证方案（例如，见法国的AFAQAP方案）中认可了这一新类别。

针对如何充分识别IHC评分为1+与0的病例展开培训可能有益。然而，值得一提的是，II期DAISY研究报告了接受新型ADC治疗的IHC评分为0的乳腺癌患者的缓解率为30%^[12]，这使得如何正确定义HER2低表达的下限值成为当前的关注重点。事实上，目前常规使用经临床验证抗体的IHC方案已经被设计用于区分HER2成瘾和HER2未成瘾的癌症。对临床试验中收集的组织样本进行数据分析，重点关注HER2低表达乳腺癌患者的治疗，可能有助于了解IHC是否是检测最佳应答者的适当方法。

HER2转化和HER2丢失

所谓的受体转化，即在给定患者的临床病史中，原发性肿瘤和转移灶之间的HR或HER2状态不一致，这对于重新考虑治疗决策具有重要影响。一方面，普遍建议重新检测一个或多个转移性病灶以进行生物标志物评估，从而更好地治疗正在发生演变的疾病。另一方面，必须承认，复检中的生物标志物转化不一定会导致基于新特征的治疗策略迅速变化。一般而言，肿瘤学家会考虑异质性（存在多发性转移时）和治疗选择的可及性问题。当生物标志物向阳性转化时，这意味着有必要在原有治疗方案中增加治疗药物，因而与给定生物标志物的表达丢失相比，其对治疗决策的影响更加显著。

不同研究调查了原发性和复发性/转移性疾病之间HER2转化的现象，早期研究报告了从0%到44%不等的广泛不一致率。为了更好地理解这一现象的真实程度，有研究者进行了荟萃分析。Aurilio等人^[13]从48项评估原发性肿瘤与局部和远处转移灶之间受体表达和HER2状态一致性的研究中选择已发表的数据，入组研究的HER2不一致率范围为0-24%。荟萃分析汇总评估的不一致率为8%。当根据复发部位分层时，HER2状态在原发性肿瘤与远处和局部区域转移灶之间的不一致率分别为10%和6%。关于HER2转化的模式，13%的患者从阳性变为阴性，5%从阴性变为阳性。

在最近的一项荟萃分析中，Schrijver等人^[14]分析了39项仅考虑远处转移病灶的研究数据，重点关注用于HER2检测的技术类型和转移部位之间的特异性差异。观察到HER2不一致率范围为0%-34%，平均值为10.3%。在21.3%的病例中观察到HER2阳性转化为HER2阴性，而在9.5%的病例中，HER2状态从阴性转化为阳性。使用FISH、IHC以及两者兼用时，总体HER2不一致率分别为11.5%、12.7%和9.8%。针对这些HER2不一致率进行汇总分析时，转移部位之间的特异性差异不具有统计学意义。

为了尽可能产生均一化的数据，Chen等人^[15]研究了来自单个机构的320例具有原发性和与之匹配的转移性样本信息的乳腺癌患者，同时考虑了HER2状态转化对预后的影响。在13.7%的病例中观察到HER2转化，28.7%的病例发生阳性至阴性转化，8.1%的病例发生阴性至阳性转化。未发现不同转移部位的HER2不一致率存在统计学显著差异；然而，作者报告多器官转移患者的HER2不一致率为14.3%，但在OS方面未发现显著差异。

ESME报告最近发表了一个大型患者队列的研究结果，显示在诊断转移性疾病时，在7.8%的病例中检测到HER2状态不一致（45.2%的病例中HER2非扩增，54.8%的病例中HER2扩增），而首次进展后，不一致率为10%（非扩增组50.9%，扩增组49.1%）。HER2不一致与OS无显著相关性^[16]。

总之，这些数据表明，原发性肿瘤和转移性疾病之间的HER2不一致更常表现为“HER2丢失”。其潜在机制尚未明确，但合理的解释表现为肿瘤异质性以及由克隆演变或治疗压力导致的特定选择。如上所述，不一定根据转移灶活检中确定的受体特征改变治疗策略；因此，关于可能的需要调整治疗策略的长期效应的数据不足。

还有研究评估了初治原发性肿瘤和新辅助治疗后微小残留病灶（RD）之间的HER2不一致。在其中一项最早的研究中，Mittendorf等人^[17]评估了新辅助化疗+曲妥珠单抗治疗后未达到pCR的25/142例患者的HER2状态，观察到32%的RD HER2丢失病例。此外，HER2过表达的丢失与无复发生存率较差相关。维持HER2扩增的患者的3年无复发生存率估计值为87.5%，显示HER2丢失的肿瘤患者占50%。Guarneri等人^[18]在两个队列中入组了107例患者，并给予新辅助化疗（队列A）或新辅助化疗+抗HER2药物（队列B）。在A队列40%的RD患者和B队列14.7%的RD患者中观察到HER2表达丢失。本研究强调，仅在新辅助化疗方案后也可发生HER2表达丢失。与维持HER2阳性的患者相比，HER2丢失的患者往往DFS较差。Niikura等人^[19]报告了相似的结果，21.4%的HER2阳性肿瘤在治疗后转化为HER2阴性，而3.4%的HER2阴性肿瘤转化为HER2阳性。在接受曲妥珠单抗的患者和未接受曲妥珠单抗的患者中观察到的HER2不一致率分别为24.7%和18.2%。

其他新辅助治疗研究同样报告了新辅助治疗过程中的HER2丢失（范围：18-42%），但与仅接受化疗的患者相比，接受曲妥珠单抗+化疗的患者残留肿瘤中HER2丢失的百分比更高。这些研究还报告了HER2丢失患者的复发风险较高。有趣的是，Ignatov等人^[20]报告了曲妥珠单抗与曲妥珠单抗+帕妥珠单抗的比较数据。在入组的205例HER2过表达肿瘤患者中，42%在新辅助治疗过程中显示HER2丢失。其中，曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合治疗组中，观察到63.2%的病例发生HER2丢失，而仅接受曲妥珠单抗时，观察到47.3%的病例发生HER2丢失。在生存结局方面，HER2一致病例的5年DFS率为74.4%，HER2不一致病例的5年DFS率为59.6%，未观察到HER2变化对OS的影响。

最后，Katayama等人^[21]还对ISH数据进行了评估。在HER2阳性肿瘤中，22.3%的患者转化为HER2阴性；此外，15.9%的HER2阴性肿瘤转化为HER2阳性。研究还评估了IHC评分为2+病例在治疗前和治疗后样本中的平均HER2基因和CEP17拷贝数。在从IHC 2+/HER2扩增转变为IHC 2+/HER2未扩增的患者中，65.2%维持相同的HER2基因拷贝数，而34.8%表现为HER2基因拷贝数下降。在从IHC 2+/HER2未扩增转变为IHC 2+/HER2扩增的患者中，76.9%维持相同的HER2基因拷贝数，23.1%显示HER2拷贝数增加。这些结果可能强调HER2基因改变的变异性极小，从阴性到阳性检测的变化最可能是由于值接近阳性阈值。

总之，这些数据表明HER2状态可能受到新辅助治疗的影响，HER2变化更常表现为丢失，并且似乎特别受到增加抗HER2治疗药物的影响。尚不清楚该现象是否反映了治疗缓解/耐药或潜在HER2异质性的表达。然而，新辅助化疗后HER2丢失似乎代表了PFS方面的不良预后因素，但不影响OS。

值得注意的是，对于HER2阳性患者，新辅助化疗后HER2重新评估是一个有争议的问题；然而，它似乎提供了相当多的信息，并将增加预后信息。KATHERINE临床试验^[22]比较了T-DM1和曲妥珠单抗在接受紫杉类+曲妥珠单抗的新辅助治疗后仍有侵袭性残留病灶的HER2阳性乳腺癌患者中的辅助治疗情况，结果显示T-DM1队列的复发或死亡风险降低50%，研究结果为如何在新辅助化疗后处理HER2阳性RD患者提供了思路。值得注意的是，该试验要求治疗前空芯针活检或RD中HER2评估结果为阳性。考虑到含曲妥珠单抗化疗过程中HER2丢失的已知现象，了解以HER2丢失为特征的RD患者是否仍可从T-DM1中获益大于曲妥珠单抗±化疗，这将是非常有意义的探索方向。

检测前阶段及其针对不同类型组织样本中

HER2表达评估的影响

IHC方法的灵敏度和乳腺癌HER2表达评估结果判读的准确性是一个老生常谈的问题。事实上，IHC针对经过福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的蛋白检测受到检测前变量的强烈影响，尤其是固定过程的影响。例如，不受控制的福尔马林固定时间和持续时间可调节免疫反应性，固定不足和过度均可引起结构和大分子改变。

为了最大限度地实现IHC程序的标准化，HER2评估的ASCO/CAP指南建议：(i)立即将组织样本在固定液中浸泡，从而最大限度地减少缺血时间(≤1h)，和(ii)固定时间为6-48h。组织采集和组织固定之间的时间不得超过60min。通过受控温度方案(4℃)或使用真空储存长达72h，可能减少宏观降解。选择的固定剂以10%中性缓冲福尔马林为代表。

在HER2检测的背景下，固定问题导致结果的重现性较差。为了更好地理解固定时间的影响，进行了比较研究，以显示福尔马林浸泡时间缩短或延长的后果。单独评估固定不足或过度固定的研究，以及比较研究显示福尔马林对以HER2蛋白“明确”表达为特征的组织的影响有限。有趣的是，无论固定时间如何，报告的HER2阴性（0分）和HER2阳性（3+分）病例的判读完全一致。另一方面，HER2检测在显示中等表达水平（评分1+和评分2+）的乳腺癌中受到影响，由此表明固定时间对HER2低表达具有显著影响，在组织保存较差的情况下可能需要进行重新检测。

与检测前条件相关的另一个关注问题与可能接受HER2检测的不同类型标本相关。粗针活检(CNB)和手术切除均代表了原发性肿瘤中用于HER2检测的适当标本（组织块的完整切片）。据报道，手术切除和CNB之间也具有高度一致性，特别是当针对给定病变进行多次空芯针活检时。后者有助于捕获肿瘤内异质性，其全貌在手术标本的样本中获取良好。最近，Miglietta等^[23]报道，与手术标本相比，当采用CNBs评估HER2表达状态时，HER2低表达病例的发生率更高，由此提示采用CNBs评估HER2低表达乳腺癌的可靠性需要更深入的评估，这一观察结果有待独立研究进一步探讨。

使用空芯针活检的优势主要与手术干预前预期肿瘤表型信息和由于CNB样本量较小获得的最佳组织固定有关。最近的研究表明，固定时间缩短（甚至数小时）不会影响HER2检测的质量和一致性，从而证实了原始ASCO/CAP指南的指示，即6-8h是活检的最佳固定时间，在极端需要的情况下可减少至1h。

活检也可用于获取转移病灶样本，并且在乳腺癌中必须根据生物标志物进行重新评估。转移部位可能存在异质性；因此，当观察到原发性肿瘤中的HER2阴性肿瘤，在转移部位转化为HER2阳性肿瘤时，通常会改变治疗方案。在某些情况下，可能通过活检针对有限的肿瘤材料进行采样，从而进一步复杂化了针对病变真实生物标志物特征的可靠评估。在这种情况下，建议与肿瘤学家积极探讨。

在这些情况下，细胞学标本也可能代表组织来源；但是，需要仔细管理固定方法。尽管已报告酒精固定在保存细胞学标本的分子成分方面非常有效，但ASCO/CAP HER2状态评估指南建议对细胞学样本进行福尔马林固定。

在讨论不同类型的组织标本和转移病灶时，骨组织管理值得单独一章。骨是乳腺癌的第一个转移部位，因此是重新评估HER2状态的重要采样部位。脱钙程序旨在去除磷酸钙，从而允许切片，目前有几种方案可用。脱钙的不利影响主要是影响核酸的质量，而IHC等方法似乎没有受到显著影响。但关注HER2评估的研究表明，脱钙确实会降低IHC的成功率，从而导致缺乏被公认作为IHC应用“金标准”的脱钙方案。鉴于可能针对HER2基因状态进行FISH评估，应考虑使用基于EDTA的方法，因为该方案显示了更好的结果。

对于IHC检测前的影响因素，ASCO/CAP指南强调了内部和外部质量控制评估对进行HER2检测的实验室的重要性。外部质量控制评估依赖于外部能力测试和现场检查的参与和完成；此外，这些建议提供了国际质量保证计划的示例。另一方面，除了使用FDA批准的检测方法的建议外，内部质量评估方案尚不明确。

在处理组织学样本时，研究往往利用组织微阵列(TMA)的优势。这是一种在一定程度上也被探索用于常规实践的技术。例如，有研究报道，在乳腺癌生物标志物评估（激素受体、HER2和Ki67）的背景下，TMA和全切片之间有95%的一致性；然而，每个病灶进行4次空芯针穿刺，以使肿瘤病灶具有适当的代表性。肿瘤内异质性极大程度地限制了TMA在常规诊断中的实施，在诊断实践中不推荐使用TMA。

研究结论

基于IHC进行的HER2表达评估在乳腺癌诊断病理学中发挥着核心作用，并已用于识别对HER2基因扩增（会导致细胞膜上HER2蛋白的大量过度表达）成瘾的乳腺癌。HER2过表达可以以不同的程度和形态存在，甚至具有一些不寻常的模式，根据ASCO/CAP提出的历史评分系统并不能完全满足其分类类别。ASCO/CAP建议承认这种模式，并就如何解决这些异常的模式发表了警告。HER2异质性可能给个体患者HER2状态的最终定义带来困难，需要与肿瘤学家讨论。患者的HER2状态在临床病史发展过程中可能发生变化，HER2表达丢失似乎比获得HER2阳性更常见。新辅助化疗后也描述了HER2丢失，似乎还包含预后信息，因此强调了重新评估未达到pCR的患者生物标志物的重要性。

最后值得一提的是，目前正在从新的角度重新审视HER2（过度）表达评估的重要性，其中特定蛋白的表达可能代表新治疗选择的靶点，“HER2低表达”就是很好的例证。这也使得IHC再次受到关注。尽管IHC在病理学实验室中的应用简单而广泛，但IHC并非没有检测前影响因素，病理学家必须意识到可能妨碍HER2准确检测的IHC性能及其评估的关键步骤，这似乎对HER2表达谱的下限值特别重要。因此，它可能对所谓的HER2低表达肿瘤的鉴定产生影响。