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今天为大家介绍一篇发表在BioMed Central出版社旗下的BMC系列期刊高影响力的期刊之一BMC medicine的文章，题目为“Computer-assisted quantification of tumor-associated collagen signatures to improve the prognosis prediction of breast cancer”计算机辅助量化肿瘤相关胶原特征以提高乳腺癌的预后预测。 
研究对象（P）：两个中心的乳腺癌患者（n=689，n=253，共942人）预后模型（I/C）：乳腺癌的肿瘤相关胶原特征（TACS）对应的显微特征评分TCMF-score研究目的：基于多光子显微成像（Multiple-Photon Microscope, MPM），研究肿瘤相关胶原结构的微观特征（TACS）的影响，从而准确、全面地预测乳腺癌患者的预后。协变量（Z）：年龄、分子亚型、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、组织学分级、雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2（HER2）、化学疗法、内分泌疗法、放射治疗、靶向治疗临床问题：胶原纤维在肿瘤的发生、发展和侵袭中起重要作用。TACS是侵袭性乳腺癌中独立于临床病理因素的强大预后生物标志物。然而，它们在宏观尺度上的观察更适合识别高危患者。为了更准确、全面地预测乳腺癌患者的预后，有必要研究TACS相应的显微特征对预后的影响。 目前方法不足：目前对TACS研究处于宏观阶段，胶原结构微观特征与乳腺癌预后之间的关系尚未得到充分探讨。本文解决方式：本文通过MPM双光子激发荧光(TPEF)和二次谐波产生(SHG)的结合，在临床样本上观察详细组织结构信息，利用SHG成像提供直接和无标记的方法观察胶原结构。将TACS 1-8相关SHG图像转换为高维可挖掘数据，提取TACS及TACS对应的显微微观特征（TCMFs），并结合两者构建TCMF模型在3个队列验证，并联合临床模型（CLI-score）来预测乳腺癌患者的预后。我们先来看一下流程图 (Figure 1)，这一研究主要分为以下几个部分：② 特征提取（形态学特征、一阶亮度直方图特征、纹理特征）TCMF+TACS-score模型中的TACS-score由岭回归构建，TCMF-score由Lasson回归构建注：TACS1-8是按胶原纤维在肿瘤周围的排列特征定义，参考文献PMID:33537084。② 缺少资料：患者缺少相关的临床病理特征或随访资料；③ 样本不适用：部分标本因损伤、无肿瘤存在或切片质量差而不适合进行分析；④ 胶原纤维稀疏：一些样本中的胶原纤维过于稀疏，无法从中提取微观特征I/C：成像设备：MPM [ (LSM 880, Zeiss, Germany) + femtosecond Ti: sapphire laser (Chameleon Ultra, Coherent)]O：DFS（定义为从诊断日期到疾病首次复发的时间、死亡日期、最后已知没有疾病证据的日期或最近一次随访的日期）回顾性收集1223例21-87岁年龄的福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌组织样本1223份，其中281份符合排除标准，最终纳入3个队列942人，并从中获得临床特征及病理特征资料，训练队列355例患者，内部验证队列334例患者，外部验证队列253例患者。 ① 由三位不知道病理结果的独立审查员首先在H&E图像上根据样本的大小对侵袭边缘和邻近肿瘤区域的若干个（7-20）离散的~2.8 mm平方的不重叠感兴趣区域（ROI）进行编号。然后，在另一个切片上基于所有编号的区域进行MPM成像。② 从MPM成像根据胶原纤维和肿瘤细胞空间位置，定义TACS 1-8，根据每位患者TACS 1-8的比例，构建TACS-score。注：TACS1-8定量的方案参考文献PMID:33537084。
计算公式
③ 从每个具有TACS的MPM图像中识别出150μm × 150μm视场的感兴趣区域（ROI）通过算法提取胶原纤维特征，构建TCMF-score。
注：使用Matlab 2016b从每个ROI中提取142个TACS相应的微观特征（TCMF），包括8个形态学特征和134个纹理特征，然后使用Z-score对所有142个TCMF进行归一化-分数转换。结果：从每个ROI中提取总共142个TACS对应的显微特征（TCMFs），其中包括8个形态学特征和134个纹理特征。 
提取TACS相应显微镜特征（TCMF）的示意图
142个TCMFs进行标准化处理（Z-score变换），最小绝对收缩和选择算子（LASSO回归）筛选出与预后相关性最大的14个微观特征。将所选特征通过各自的LASSO系数加权线性组合得到一个公式，然后应用该公式获得每个患者的TCMF-score，再采用多变量COX回归分析计算各评分（TCMF-score、TACS-score、CLI-score）的相对权重，然后将各评分及其相对权重线性组合，建立综合预后评分（TCMF+TACS或CLI+ TCMF+TACS）。
校准曲线、受试者工作特征（ROC）曲线、时间依赖性AUC曲线评估模型性能。
受试者工作特征（ROC）曲线与曲线下面积（AUC）不同风险组合患者不同预测模型（TCMF、TACS和TCMF+TACS）的一致性指数（C指数）结果显示：CLI+TCMF+TACS（训练队列：AUC 0.905；内部验证队列：AUC 0.896；外部验证队列：AUC 0.882）具有良好的预测效果。这些模型的预测性能在内部和外部两个验证队列上总体上是稳定的。2.TCMF-score风险评分与DFS之间的关系选择R软件包“glmnet”进行LASSO Cox回归模型分析训练队列中每个TCMF特征与DFS之间的关联。 结果显示：评分越低（TCMF-score、TACS-score和TCMF+TACS-score）预后越好（5年DFS越高），评分越高预后越差（5年DFS越低）。大多数大于5年的柱为蓝色，预后较好，大多数小于5年的柱为红色，预后较差。使用单因素Cox比例风险回归分析显示，TCMF-score与DFS之间的关系。 结果显示：高TCMF-score与更高的复发风险相关（HR 3.667，[2.716-4.953]， P < 0.0001）。在多因素Cox回归分析调整混杂后，TCMF-score仍然是DFS的独立预后因素（HR 1.911，[1.407 - 2.595]， P < 0.0001）。
结果显示：TCMF+TACS模型通过六个临床变量预测所有类别的5年DFS。低风险评分的患者在5年的复发频率低于高风险评分的患者。
① 通过训练队列中的最大约登指数来确定最佳截止值分为高危组、低危组。
根据TCMF+TACS评分分类器，所有患者5年复发的风险比在按临床参数分层的不同亚组中
② 评估不同模型在不同亚组的风险分层和预测5年DFS的能力。 结果显示：在三个队列中，临床病理特征的分布在高危组和低危组之间没有显著改变。TCMF模型优于CLI模型，显著提高了分类准确率，特别是在一些低风险变量亚组（luminal A: HR, 5.738, AUC, 0.827;luminal B: HR, 4.647, AUC, 0.835;G1级:HR, 5.206, AUC, 0.811;G2级:HR, 4.122, AUC, 0.794;阳性:HR, 5.174, AUC, 0.833;pr阳性:HR, 6.026, AUC, 0.844;her2阴性:HR为4.083,AUC为0.790)。③ 采用Kaplan-Meier生存分析（log-rank检验）分析两组间的生存差异。评估各队列中低危组和高危组的生存差异。
结果显示：预测高危组DFS较低危组差。在风险分层方面，三个队列中TCMF模型的风险比（HR）值均高于CLI模型，说明其风险分层能力优于临床预后因素（HR，训练4.4 vs. 3.8，内部验证3.5 vs. 3.3，外部验证3.4 vs. 2.9）。本文基于MPM成像和计算机自动提取肿瘤胶原特征（TACS）和其微观特征（TCMF）建立了预后评分模型，并联合临床模型结合临床无病生存期（DFS）预测提高乳腺癌的预后预测。本文基于MPM成像，构建了一个能够用于挖掘肿瘤相关胶原微观特征的系统，并构建了一个TCMF得分，能够提高乳腺癌的预后预测效果。 ② 采用计算机自动从MPM图像中提取高空间分辨率胶原纤维的显微特征，更加精确地识别胶原纤维的变化情况。③ 使用无标记MPM显微成像胶原纤维，比传统病理成像减少样本损伤，具更高的空间分辨率、更少的染色偏差、更全面的视角，尤其是在深层组织成像方面。这使得本研究能够更清晰地观察胶原纤维的结构和排列，还能提供关于组织的生物化学和分子信息，如胶原纤维的交联情况。④ 建立的TCMF+TACS-score能反映乳腺肿瘤微环境中胶原纤维的微观和宏观形态变化，判别准确率高，风险分层能力强，在预后表现方面远远优于现已建立的临床病理因素，突出了肿瘤微环境在癌症进展中的重要作用。从文章的实验设计与总体内容来看，做的比较规范，质量佳，是个学习的好模板。① 从信息获取层面来说，只用了肿瘤区域的特征，而肿瘤区域内不同亚区或者细胞结构的注释，亦或者瘤周区域的特征等均值得进一步的探索，同样，联合图神经网络等深度学习模型亦是本研究可提高的内容。② 从临床意义的层面来说，Nature的研究发现胶原的规则排列会影响免疫细胞的浸润（PMID：34732895），因此围绕近两年乳腺癌新辅助治疗的疗效评价、免疫治疗、胶原结构与免疫细胞浸润等，均是本研究可进一步挖掘的亮点。本研究套路简单，作为回顾性研究，操作简单，时效性很强，有样本就能发，核心壁垒主要是高大上的多光子成像设备，千万级别的高端仪器，真香！今天的分享就到这啦，跟紧我们的脚步，轻松拿下SCI！我们下次再一起探索CI的赛道~高质量多光子成像套路，可扫码联系栗子糕老师进行体验↓↓↓
