揭示从年轻到中年的心血管健康演变：DNA甲基化作为未来心血管疾病风险预测的新视角 — CARDIA研究解读

心血管健康（Cardiovascular health, CVH）在人的整个寿命中起着至关重要的作用，尤其是自年轻成年期开始的心血管健康状况，与个体未来心血管疾病（Cardiovascular disease, CVD）的风险及总死亡率有着强烈的相关性。研究表明，维持理想的心血管健康水平至中年甚至能基本消除剩余的终生CVD风险，并带来更长的健康寿命，降低全因死亡率和医疗支出，提高老年时的生活质量。

然而，研究还发现，心血管健康从儿童时期到年轻成年期间显着下降，在到达中年时，只有不到5%的美国人能够保持高水平的心血管健康。因此，预防成年期心血管健康的损失或中断不良心血管健康向亚临床心血管疾病的转变可能在大幅减少CVD发病率和死亡率方面发挥重要作用。

DNA甲基化是一种众所周知的表观遗传修饰，它作为环境暴露的调节性修改能影响基因表达。环境及生活方式因素已与血液DNA甲基化生物标志物的变化相关联，而这些甲基化的变化可能在分子层面上记录了个体整体的心血管健康状态。这些表观遗传变化因此可能代表了心血管健康暴露、基因表达模式控制以及未来CVD发展之间的重要潜在生物学联系。

本研究的主要目标是明确年轻成年期到中年的累积心血管健康暴露与中年期反复测量的全基因组DNA甲基化模式之间的关联，进一步理解这些表观遗传变化是如何介导从较差的心血管健康到亚临床CVD的过渡。

纵向队列研究：使用CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 青年冠状动脉风险的发展研究）研究的数据集，其中包括1085名参与者的血液DNA甲基化数据，这些数据在15年（Y15）和20年（Y20）的两次检测中获得。此外，采用来自FHS(Framingham Heart Study, 弗莱明翰心脏研究)研究的数据集作为数据分析时的对照组。

临床CVH评分定义：结合体重指数、血压、总胆固醇和空腹血糖四项指标，从年轻成年期至中年期计算每位参与者的累积心血管健康分数。

全基因组关联分析（EWAS）：通过多元线性回归模型，调整年龄、性别、种族、学习中心、教育、技术批次因素和估计的血细胞类型比例等协变量，以确定与累积CVH评分相关的甲基化标记。

惩罚性回归建模：使用惩罚性回归建立基于甲基化的风险评分（MRS），评估冠状动脉钙化和临床CVD事件的风险。

此实验方法的特点如下：

覆盖广泛：EPIC阵列能够覆盖广泛的基因组区域，提供大规模的甲基化数据分析。

重复性高：采用两个时间点的甲基化数据提高了发现的可靠性。

调整多方面因素：通过调整多个协变量，降低混杂变量影响，提高了结果的稳健性。

纵向研究设计：可以评估时间相关的变化和长期风险。

交叉验证：将CARDIA数据与FHS数据比较，提高研究发现的普遍性和可信度。

图1 研究设计

这个流程图展示了整个研究的设计和执行步骤。其中包括在CARDIA研究中通过EPIC芯片得到甲基化数据，并进行全基因组关联分析（EWAS）来鉴定与累计CVH显著相关的甲基化标记。在FHS中，使用450K芯片的数据进行交叉验证。此外，还进行了多种额外分析以提高CARDIA中心血管健康相关甲基化标记的稳健性，如按种族和性别分层分析、敏感性分析、前瞻性分析及CVH与甲基化变化分析。最后，研究人员对鉴定出的甲基化标记进行了基因注释、调节标记富集和功能分析，并评估了这些标记预测冠状动脉钙化风险的潜在临床应用。

表1 年轻人冠状动脉风险的发展研究和弗雷明汉心脏研究参与者的特征

表1 提供了CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 年轻人冠状动脉风险的发展研究）和FHS（Framingham Heart Study,弗莱明翰心脏研究）参与者的特性概览。包含的主要信息是：有 CARDIA的平均年龄在Y15是40岁，在Y20是45岁。相比之下，FHS的Third Generation（第三代）队列的平均年龄也是45岁，但年龄范围更广（24-71岁）。FHS的Offspring（子代）队列的平均年龄是65岁，年龄范围是更宽的40-90岁。以及其他人口统计信息，如性别、种族、教育水平、是否过量饮酒、吸烟状态、既往疾病史、有关体育活动水平、BMI（体重指数）、血压、胆固醇和血糖控制等，也包含在内。

图2 用于临床心血管健康的 DNA 甲基化标记

图2中，A和B是两个圆形的曼哈顿图，它们分别展示与年轻成年期到中年期不同时间点心血管健康（CVH）评分相关的DNA甲基化标记。在图2A中，Y15是指在平均年龄40岁时的数据，图2B中的Y20则代表在平均年龄45岁时的数据。外环显示了与累积CVH评分最相关的甲基化标记，而随着向内环移动，代表越早期的CVH测量时间点与甲基化评分的关联。红色的点表示不同时间点测量的CVH评分与甲基化水平之间存在显著相关的标记。图中的基因标签表示距离甲基化标记最近的基因，颜色的渐变表示这些标记与基因转录起始点（TSS）的距离。通过此图，我们可以看出甲基化标记与累积CVH之间的相关性如何随时间而增强，同时还可以识别出与心血管健康变化关联最紧密的基因。

图3 45个已鉴定的心血管健康相关甲基化标记物的一致性检验

图3 提供了对比分析，检验心血管健康（CVH）相关的45个DNA甲基化位点之间的一致性。这个一致性是通过这些位点在不同研究中的相关性系数（β系数）表示的。

图3A 展示了CARDIA研究中的两个时间点（Y15比Y20）甲基化的β系数比较。点越靠近图中的对角线，表示Y15与Y20测量的甲基化标记之间的一致性越高。图中标出的偏离对角线的点表示Y20时测量甲基化标记的关联性比Y15时更强。

图3B 和 图3C 分别比较了CARDIA研究中的甲基化标记与FHS研究的Offspring和Third Generation队列中的甲基化标记之间的相关性。高度的一致性表示这些CVH相关的甲基化标记在跨越不同人群和时间点的研究中都有相似的表现。

图3D 和 图3E 使用盒图展示了这些甲基化标记在CARDIA和FHS中每个时间点P值（-log10 转换后）的水平，体现随着时间的推移、随着参与者年龄增长，关联性的增强。

这些分析提供了我们研究发现的渡跨性证据，以及随着年龄增长这些甲基化标记与CVH之间关联性增强的动态图景。

图4 基因本体功能注释及富集分析山脊图

图4 通过Ridge Plot（山脊图或称脊线图）展示了基因富集分析的结果。图中展示了根据基因本体论（GO）富集的最重要几个GO术语的基因-甲基化关系。GO术语反映这些基因在细胞活动中的功能。水平的线展示了不同GO术语对应基因的甲基化标记β系数的分布情况。取正值的β表示在更好的CVH关联下基因甲基化水平偏低（即假设此甲基化位点与基因表达为负相关时，基因被上调），而取负值则表示这些标记在更好的CVH关联下基因甲基化水平偏高（基因被下调）。

这些分析揭示了在不同的生物学过程中，DNA甲基化状态如何在良好心血管健康状态下区分表现为高度甲基化或低度甲基化。例如，表现为高度甲基化的"细胞因子产生"和"白细胞分化"过程可能反映抑制功能，而"胰岛素分泌"和"脂质代谢"过程中偏低的甲基化与这些功能的激活相关。

图5 心血管健康相关甲基化标志物的临床意义

图5A 显示了三个甲基化位点在心血管健康和冠状动脉钙化（CAC）之间的潜在中介作用。这三个位点位于SARS1、LINC-PINT和SOCS3基因中，它们的甲基化水平统计上中介了15年累计CVH对CAC风险的20.4%的影响。方向性箭头α和β表示了CVH与甲基化水平以及甲基化与CAC风险之间的相关系数，而中介的比例是通过这些系数的乘积计算得出的，即甲基化位点如何在CVH对CAC风险的总体影响中发挥了一定的作用。

图5B 依据甲基化风险评分（MRS）将参与者分成三组，并展示了在不同CVH状态下参与者发生CAC的风险。图中可以看到在中等（5或6分）和差（少于等于4分）CVH分数的个体中，MRS得分高的组与CAC发生的风险显著相关。而在保持理想CVH状态的个体中，MRS没有显著的预测作用。

图5C 通过比较接受者操作特征曲线（ROC），检验了在预测CAC风险时仅使用累计CVH评分与联合使用CVH评分和MRS的效能。这种分析可以帮助评价MRS作为一个独立工具在风险预测上的额外价值。ROC曲线下的面积（AUC）从0.71增加到0.77，说明添加MRS能提高对CAC状态的预测准确性。

图5 显示了心血管健康（CVH）相关的甲基化标记在临床应用方面的潜在价值，强调了将甲基化标记转化为预测心血管疾病风险的工具的可行性，表明基于甲基化的指标能够补充传统的心血管健康评分并提供更精准的风险评估，这可能在临床预防策略和早期干预中发挥重要作用。

表2 CARDIA 甲基化风险评分与 FHS 心血管疾病发生之间的关联

表2 展示了在CARDIA开发的基于甲基化的风险评分（MRS）与紧随其后在FHS中心血管事件发生风险的关联。表中所示的每一分MRS增加，心血管事件的风险比例（hazard ratio, HR）表明MRS与未来心血管疾病事件的发生呈正相关，即MRS分数越高，发生心血管疾病的风险越大。此数据支持了将MRS作为一个可能有用的工具来评估心血管疾病风险。

在讨论遗传影响方面，他们提到，尽管许多表观遗传生物标记与年龄相关，但本研究中发现的45个CVH相关的甲基化标记并未涉及已有的甲基化衰老生物标记，并且与衰老生物标记仅有弱相关性。这暗示了这些发现的标记更可能与慢性CVH曝光的累积效应连接，通过并非与衰老途径相关的机制影响CVD的临床表现。

研究人员也讨论了这些甲基化标记的功能，强调在脂质代谢、炎症调节和血管功能等关键的CVD途径中发现的基因。他们特别指出，降低的CVH分数与某些基因的甲基化状态显著相关（如CPT1A、ABCG1、SREBF1、SOCS3等），这些基因在动脉粥样硬化和心血管疾病的形成中发挥关键作用。

此外，对于所发现甲基化标记的临床应用，他们发现甲基化风险评分能提升对亚临床心血管疾病（如冠状动脉钙化）的风险分层能力，并且在FHS中对临床CVD事件的预测中也显示出关联性。这表明该风险评分在早期诊断和CVD风险评估中有潜在的临床价值。

论文最后强调，识别这种与心血管健康变化相关的甲基化标记，不仅可以改善未来CVD的风险分层，还为研究从优良CVH到亚临床CVD发展的机制提供了新的见解，有可能揭示新的预防和治疗目标。这项长期的甲基化变化研究强调了中年时期干预的重要性，并指出在心血管疾病的预防和早期检测中应用这些生物标志物的可行性。